重組蔗糖異構酶的制備及應用條件優(yōu)化*

程勝，段緒果，吳敬

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

異麥芽酮糖(isomaltulose)，又稱帕拉金糖，是蔗糖的同分異構體，是一種功能性二糖，與蔗糖有著相似的物理性質(zhì)和口感［1-3］。不同于蔗糖，異麥芽酮糖作為一種新型甜味劑，它具有甜度低、非致齲齒性［4］，被人體食用后，在血液中釋放單糖的速度緩慢且不刺激胰島素的分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪過多的積累，適合糖尿病和肥胖人群食用［5］。與蔗糖相比，異麥芽酮糖具有良好的酸穩(wěn)定性、極低的吸濕性和無毒性，非常適合在食品上應用。與蔗糖不同的是，異麥芽酮糖作為一種還原糖，可以作為前體繼續(xù)加氫生成異麥芽酮糖醇，相比于異麥芽酮糖，異麥芽酮糖醇有著更優(yōu)良的性質(zhì)，是一種新型的功能性食用糖醇，更是一種最理想的代糖品［6-7］。

蔗糖異構酶(EC 5.4.99.11)，也稱異麥芽酮糖合酶，是生物法轉化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖最合適的酶，該酶轉化蔗糖的主產(chǎn)物是異麥芽酮糖，同時轉化過程中伴隨少量單糖(葡萄糖和果糖)的生成［8-14］。1995年，Ralf等人首次將來源于 Protaminobacter rubrum CBS 547.77的蔗糖異構酶在E.coli中進行了成功的表達［15］;2010年，Park等實現(xiàn)了Enterobacter sp.的蔗糖異構酶編碼基因在Lactococcus lactisMG1363中異源表達，并實現(xiàn)該酶的胞外分泌［16］;Lee等在2011年將來源于 Enterobacter sp.的蔗糖異構酶在Saccharomyces cerevisiae EBY100進行成功的表達，并且實現(xiàn)此酶在酵母細胞的表面展示［17］。異麥芽酮糖的生產(chǎn)目前主要有3種方法:單酶轉化、游離細胞轉化和固定化細胞［13-14，18-20］。1999年，Veronese等［13］用來源于 Serratia plymuthica ATCC 15928蔗糖異構酶，以10%蔗糖為底物，轉化5 h，異麥芽酮糖的轉化率為 72.6%。Amornrat［12］以20%蔗糖為底物，用Klebsiella pneumoniae NK33-98-8來源的蔗糖異構酶進行催化，最終異麥芽酮糖的轉化率為76.8%。Lee等［21］以20%蔗糖為底物，用Protaminobacter rubrum CBS 547.77來源的蔗糖異構酶進行催化，得到異麥芽酮糖的轉化率為88.5%。Cha等［14］將來源于Enterobacter sp.FMB-1蔗糖異構酶在E.coli里進行表達，利用游離細胞進行催化，以6%蔗糖為底物，轉化16 h，異麥芽酮糖的轉化率為78%。

本研究將前期構建的表達質(zhì)粒pET-24a/palI轉化Escherichia coli BL(DE3)，構建得到產(chǎn)重組Serratia plymuthica AS9蔗糖異構酶的重組菌株。在搖瓶和3 L發(fā)酵罐條件下對重組菌產(chǎn)酶情況進行初步考察基礎上，對轉化工藝進行優(yōu)化，以獲得高效生產(chǎn)異麥芽酮糖的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichia coliBL21(DE3))和重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-palI為本實驗室保藏［22］。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，卡那霉素的終濃度為30 μg/mL。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2hpo412.54，KH2PO42.31，甘氨酸 0.75%，卡那霉素終濃度為30 μg/mL。

3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油8，工業(yè)蛋白胨1，工業(yè)酵母粉 2，檸檬酸 1.7，(NH4)2HPO44.0，KH2PO413.5，MgSO4·7H2O 1.39，微量元素液 10 mL，調(diào) pH 到7.0

微量元素液 (g/L):FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，(NH4)6Mo7O240.1。

補料液 (g/L):甘油 500，MgSO4·7H2O 15，工業(yè)級酵母粉4，工業(yè)級蛋白胨1.0。

1.1.3 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;卡那霉素購自上海生工生物有限公司;蛋白電泳試劑和蛋白分子質(zhì)量標準購自南通碧云天技術研究所;酵母粉、蛋白胨購自Oxoid(英國)公司;異麥芽酮糖、海藻酮糖標樣購自Sigma公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器

凝膠成像儀、蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司;Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;細胞破碎儀，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;3 LInfors全自動發(fā)酵罐，伊孚森生物技術有限公司(中國)。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)蔗糖異構酶

種子培養(yǎng):從-80℃保存的甘油管接2%菌液至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min，培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)基使用前添加30 μg/mL卡那霉素。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以5%的接種量接入添加了30 μg/mL卡那霉素的TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600約為1.5 h，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG同時降溫至25℃進行誘導，在200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結束后離心收集發(fā)酵上清液，即為蔗糖異構酶粗酶液。

超聲破壁:用50 mmol/L，pH 7.0的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液將細胞沉淀復溶到OD600為5，用超聲波細胞破碎儀進行破壁處理，離心收集破壁上清檢測蔗糖異構酶胞內(nèi)表達情況。

1.2.2 重組菌在3 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量將種子接種于含有30 μg/mL卡那霉素的工業(yè)級LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h。將種子液以8%的接種量接入3 L Infors全自動發(fā)酵罐中，初始裝液量為1.2 L，初始pH為7.0，初始溶氧校為100%，30 μg/mL的卡那霉素以1.5 mL/L加入發(fā)酵罐中，初始轉速設為200 r/min。33℃恒溫發(fā)酵，控制轉速與溶氧偶聯(lián)，維持溶氧水平在30%左右，用25%氨水控制pH 7.0左右。初始培養(yǎng)基中甘油耗盡后，溶氧開始反彈，將補料液按照比生長速率μ=0.2 h-1進行指數(shù)流加。同時每隔12 h加1次滅過菌的30 μg/mL的卡那霉素;當DCW為15 g/L，接入10 g/L甘氨酸;當DCW為50 g/L，恒速0.4 g/(L·h)流加10%的乳糖進行誘導，補料液流量梯度遞減，整個發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.2.3 蔗糖異構酶酶活測定方法

將100 μL適當稀釋的酶液加入到900 μL含有蔗糖的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 6.0)中，使蔗糖的終質(zhì)量濃度為100 g/L。振蕩混勻后置30℃水浴鍋中反應15 min，滅酶，離心。反應樣品中蔗糖、異麥芽酮糖、海藻酮糖、葡萄糖和果糖的含量利用HPLC進行檢測，檢測器為示差檢測器。

酶活單位定義:在上述條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.4 酶轉化蔗糖生成異麥芽酮糖的反應條件優(yōu)化

1.2.4.1 pH值對蔗糖異構酶轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

配制pH 4.0～8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，以20%的蔗糖為底物，分別溶解于不同pH的緩沖液，加酶量為1 g蔗糖加酶15 U，置于30℃，150 r/min的水浴搖床，轉化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.2 溫度對蔗糖異構酶轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%的蔗糖為底物，加酶量為15 U/g，反應初始 pH 6.5，分別在20、25、30、35、40 和45 ℃水浴搖床轉化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.3 加酶量對蔗糖異構酶轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%蔗糖為底物，反應初始pH 6.5，加酶量分別為5、10、15、20、25 和 30 U/g，置于 30 ℃，轉速為150 r/min的水浴搖床，轉化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.4 反應時間對蔗糖異構酶轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%的蔗糖為底物，加酶量為20 U/g，初始pH 6.5，置于30℃，轉速為150 r/min的水浴搖床，每2 h取樣500 μL，HPLC檢測異麥芽酮糖的生產(chǎn)量。

1.2.4.5 底物濃度對蔗糖異構酶轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

分別配制10%、20%、30%、40%和50%的蔗糖，加酶量為20 U/g，初始 pH 6.5，置于30℃，轉速為150 r/min的水浴搖床，轉化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.5 HPLC檢測含量

轉化后的樣品經(jīng)過加熱滅酶后，12 000 r/min離心10 min，取上清用去離子水適當稀釋，備用。HPLC檢測色譜條件是:Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱4.6 mm×250 mm 5 μm Syncronis Amino Column;Aginent示差檢測器;流動相為V(乙腈)∶V(水)=80∶20，流速為 0.8 mL/min;柱溫30℃。

2 結果

2.1 重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-palI產(chǎn)蔗糖異構酶

2.1.1 重組蔗糖異構酶的表達及搖瓶產(chǎn)酶曲線

從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～10 h。轉接TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，于25℃進行誘導，誘導后每隔3 h取樣測酶活，結果如圖1所示。

圖1 重組菌在TB培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Sucrose isomerase production by E.coli in TB medium

誘導前24 h胞外酶活以較快的速度增加。誘導24 h時，離心取得上清即為粗酶液。菌體沉淀用緩沖液懸浮均勻，超聲破碎儀進行細胞破碎，離心取得胞內(nèi)上清。酶活測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h胞外酶活達到最大值為253.1 U/mL，胞內(nèi)上清酶活為110.2 U/mL。SDS-PAGE電泳(圖2)顯示，在65 kDa處有目的蛋白條帶，與理論的蔗糖異構酶分子質(zhì)量相符合，表明蔗糖異構酶在E.coli BL(DE3)中成功表達。

圖2 蔗糖異構酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the sucrose isomerase

2.1.2 3 L罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖異構酶

重組菌3 L發(fā)酵罐條件為:發(fā)酵溫度33℃，pH 7.0，溶氧水平控制在30%左右，當溶氧迅速反彈時，開始以指數(shù)流加方式添加補料液。當DCW為15 g/L，開始加入乳糖誘導，實驗中，在其他條件不變下流加乳糖濃度分別為 0.2、0.4、0.8 g/(L·h)，誘導發(fā)酵33 h。結果如圖3所示。

重組菌的胞外酶活如圖3所示，其中在0.4 g/(L·h)乳糖誘導濃度下，當誘導30 h時胞外酶活和總酶活均是最高，胞外酶活為654 U/mL，分別是0.2和0.8 g/(L·h)誘導濃度下的1.52和1.43倍;總酶活為1 012 U/mL，分別是0.2和0.8 g/(L·h)誘導濃度下的1.12和1.23倍。此時蔗糖異構酶的胞外酶活占總酶活的61.6%。因此，乳糖的誘導濃度應該選擇0.4 g/(L·h)。同時，雖然不同乳糖濃度誘導下酶活力不同，但是其中它們的胞內(nèi)酶活在誘導18 h均能達到最大值，隨著誘導時間的延長，胞內(nèi)酶活不斷分泌到胞外，使得胞內(nèi)酶活力逐漸下降，而胞外上清酶活繼續(xù)增大，當誘導30 h，重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的胞外酶活均能達到最大值。與搖瓶酶活力相比，重組蔗糖異構酶在3 L罐中最高胞外酶活是搖瓶酶活力的2.58倍。

圖3 重組菌3 L罐產(chǎn)酶過程Fig.3 Sucrose isomerase production by E.coli in 3 liter fermentor

本實驗的研究結果認為重組蔗糖異構酶的乳糖誘導濃度不是越高越好，濃度過高可能會導致蛋白合成速度過快，使得包涵體積累，導致總酶活下降，影響酶的胞外分泌效果。在0.4 g/(L·h)乳糖誘導濃度下，蛋白的表達與分泌得到了較好的協(xié)調(diào)與統(tǒng)一，因而胞外酶活較其他誘導濃度有較大的提高。

2.2 重組蔗糖異構酶生產(chǎn)異麥芽酮糖轉化條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH的影響

如圖4所示，當pH為6.5時，異麥芽酮糖轉化率最高，達到82.5%。當pH為4.0時，異麥芽酮糖的轉化率最低僅為2%。pH在5.5～7.5時，異麥芽酮糖的轉化率均高于75%，pH為8.0時，轉化率又下降到54.2%，說明了pH中性條件適合酶的轉化，偏酸偏堿都不利于異麥芽酮糖的生成。從酶反應動力學的角度分析，pH的影響可能是因為它改變了酶活性部位有關基因的解離狀態(tài)。在最適pH值時，酶活性部位基團解離狀態(tài)最適合于酶分子對底物的催化，酶活力高，因此蔗糖轉化率最高;而高于或低于最適pH值時，酶分子上活性基團的解離狀態(tài)不利于酶對底物分子的催化，酶活力下降。因此反應最適pH選為6.5。

圖4 初始pH蔗糖異構酶轉化的影響Fig.4 Effect of initial pH on the enzymatic conversion

2.2.2 反應溫度的影響

如圖5所示，30℃下，異麥芽酮糖轉化率達到最大值82.5%。同時，隨著溫度的升高或者下降，異麥芽酮糖含量下降，但是單糖含量(葡萄糖和果糖)由6.2%升高至16.5%(數(shù)據(jù)未展示)。ZHANG等［10］研究來源于Klebsiella sp.LX3蔗糖異構酶發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響酶轉化生產(chǎn)產(chǎn)物的比例，較高的溫度有利于生成單糖;WU等［9］年報道稱來源于Klebsiella planticola蔗糖異構酶在轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖時，當溫度低于30℃，溫度的降低有利于海藻酮糖的生成。蔗糖異構酶催化蔗糖生成異麥芽酮糖的過程，同時包含兩個過程，水解反應和異構反應。水解反應主要是水解蔗糖生成葡萄糖和果糖;異構反應主要是蔗糖中兩種單糖連接的糖苷鍵發(fā)生轉換，異構生成異麥芽酮糖和海藻酮糖兩種同分異構體。當溫度升高時，反應有利于水解過程，故單糖量釋放增加。而當溫度較低時，反應雖然有利于異構過程，但此時酶的構象更有利于生成海藻酮糖。故本實驗選用30℃作為最適反應溫度。

圖5 反應溫度對蔗糖異構酶轉化的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzymatic conversion

2.2.3 加酶量的影響

如圖6所示，隨著加酶量的增多，異麥芽酮糖的轉化率也在不斷地增加，當加酶量為20 U/g時，轉化達到最大86.9%。之后，隨著加酶量的增加，異麥芽酮糖轉化率稍微降低，而單糖含量有所增加。如2.2.2所述，蔗糖異構酶催化過程包括兩個反應:水解反應和異構反應。當反應體系中加酶量超過20 U/g時，可能會稍微增強水解反應的進行，從而有利于釋放單糖。所以，20 U/g的加酶量是蔗糖異構酶轉化蔗糖過程中最優(yōu)加酶量。

圖6 加酶量對蔗糖異構酶轉化的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on the enzymatic conversion

2.2.4 反應時間的影響

如圖7所示，隨著轉化時間的延長，異麥芽酮糖轉化率也隨之提高，轉化8 h時，轉化率達到最大值86.9%，之后，隨著時間的延長，轉化率基本不變。蔗糖異構酶在轉化蔗糖生成異麥芽酮糖的過程中，在起始的3 h內(nèi)酶催化反應速率是整個反應過程中的最大值。3 h時轉化率即可達到66.9%。在3～8 h內(nèi)，催化反應速率逐漸減小，異麥芽酮糖的產(chǎn)生量在8 h達到最大值。因此，最佳轉化時間可以選擇為8 h。

圖7 反應時間對蔗糖異構酶轉化的影響Fig.7 Effect of transform time on the enzymatic conversion

2.2.5 底物濃度的影響

如圖8所示，當蔗糖底物濃度為400 g/L時，轉化率可以達到87.9%。蔗糖濃度低于400 g/L時，異麥芽酮糖的生產(chǎn)量隨著底物濃度的增加小幅度增加。而500 g/L蔗糖為底物時，不僅轉化率下降到83.2%，同時轉化過程中發(fā)現(xiàn)，在此濃度下，體系在反應后期出現(xiàn)了少數(shù)懸浮的球狀小體，推測可能是在高濃度的蔗糖濃度下，體系水活力較低，加之蔗糖異構酶本身不穩(wěn)定，所以出現(xiàn)了少數(shù)的蛋白質(zhì)聚集。因此，400 g/L濃度的蔗糖是最合適的。

圖8 底物濃度對蔗糖異構酶轉化的影響Fig.8 Effect of substrates concentration on the enzymatic conversion

3 討論

早在 1983 年，F(xiàn)ujii等［23］從 Serratia plymuthica NCIB 8285中分離得到蔗糖異構酶，之后通過固定化細胞轉化蔗糖，生成的產(chǎn)物包括異麥芽酮糖、海藻酮糖、葡萄糖和果糖，此外還有極少量的異松三糖生成。1999 年，Veronese 等［13］從 Serratia plymuthica ATCC 15928得到蔗糖異構酶，并對該酶進行純化，對得到的純酶進行相關酶學性質(zhì)的研究。進一步通過實驗證明了在蔗糖轉化異麥芽酮糖過程中葡萄糖是蔗糖的競爭性底物，同時提出溫度可能是影響酶催化反應的關鍵因素。南京工業(yè)大學任賁等人［24］在E.coli克隆表達來源于Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖異構酶，對重組菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件及誘導劑進行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，蔗糖異構酶的最大酶活為14.72 U/mL。在上述研究的基礎上，本研究在E.coli BL21(DE3)中成功表達了來源于Serratia plymuthica AS9的蔗糖異構酶基因(palI)，重組菌搖瓶發(fā)酵胞外酶活為253.1 U/mL。3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵初步研究得到胞外最大酶活654 U/mL，也是目前文獻報道的最高酶活。下一步研究重點是將該重組菌在3 L發(fā)酵罐中進行優(yōu)化，獲得更高表達量的蔗糖異構酶酶液。

國內(nèi)南京工業(yè)大學李莎等［11］在大腸桿菌中克隆表達來源于Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖異構酶，任賁等［25］利用該重組酶轉化濃度為55%的蔗糖，可以得到異麥芽酮糖的轉化率為83%。李莎等［11］之后利用重組菌游離細胞轉化55%的蔗糖，最終異麥芽酮糖的轉化率達到87%。本研究在考察了pH對酶轉化的影響的基礎上，對其他的影響條件，如溫度、加酶量、轉化時間以及底物濃度等進一步研究，最終把異麥芽酮糖的轉化率提高到87.9%，同時底物濃度達到40%，是目前文獻報道在400 g/L底物濃度下，單酶轉化蔗糖生成異麥芽酮糖的最大轉化率。

此外，大部分微生物來源的蔗糖異構酶熱穩(wěn)定性較差［8-10，12］，最適溫度為30～40 ℃。本研究中的重組蔗糖異構酶在50℃下半衰期僅為8 min左右，熱穩(wěn)定性較差。同時蔗糖作為微生物豐富的碳源，低溫下轉化過程容易引起其他微生物的生長和消耗蔗糖，不利于酶轉化反應的連續(xù)進行。因此，在后續(xù)的工作中考慮到利用定點突變來提高蔗糖異構酶的熱穩(wěn)定性，進一步滿足工業(yè)上酶轉化反應在較高溫度下的連續(xù)進行。

4 結論

本研究中重組E.coli BL(DE23)/pET-24a-palI菌株能夠高效分泌表達蔗糖異構酶，搖瓶發(fā)酵初步研究得到胞外上清酶活253.1 U/mL，3L發(fā)酵罐中在0.4 g/(L·h)乳糖誘導濃度下高密度發(fā)酵得到發(fā)酵上清的最大酶活可達到654 U/mL。對該重組蔗糖異構酶轉化蔗糖生成異麥芽酮糖酶法轉化條件進行了優(yōu)化。結果表明，最優(yōu)條件為底物濃度為400 g/L，反應初始pH 6.5，溫度30℃，加酶量20 U/g，轉化時間8 h，異麥芽酮糖可以達到最大轉化率87.9%。

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