枯草芽孢桿菌二步發(fā)酵法生產(chǎn)5’-肌苷酸*

何菊華，吳雪嬌，謝希賢，2，3，徐慶陽，2，3，張成林，2，3，陳寧，2，3

1(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)

5’-肌苷酸(inosine 5’-monophosphate，5’-IMP)常以二鈉鹽形式存在，為5’-肌苷酸二鈉(disodium 5’-inosinate，IMPNa2)，廣泛存在于肉類和蘑菇中。1913年，日本的小玉新太郎發(fā)現(xiàn)煮沸的金槍魚輔湯帶有的鮮味來自于5’-IMP，隨后其作為鮮味劑廣泛使用［1］。5’-IMP作為膳食核苷酸，對嬰幼兒的腸道發(fā)育也十分重要，常被添加到嬰幼兒配方奶粉中［2］。

5’-IMP的生產(chǎn)最早主要是依靠化學合成法和水解法。隨著學者們對微生物發(fā)酵法的不斷深入研究，發(fā)酵技術(shù)越來越成熟，人們開始嘗試用微生物發(fā)酵法直接發(fā)酵生產(chǎn)5’-IMP［3］。直接發(fā)酵法中，由于肌苷酸是一種羰基磷酸酯，極性大，難以透過細胞膜排出胞外，而產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)具有“分段式”合成5’-IMP的能力，即利用分泌到胞外的補救合成途徑酶系以及次黃嘌呤和5-磷酸核糖-1-焦磷酸重新合成肌苷酸，能夠有效解決肌苷酸跨膜運輸困難的問題［4］，因此利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)中主要以產(chǎn)氨棒桿菌為生產(chǎn)菌。但該工藝發(fā)酵周期較長(約120 h)且發(fā)酵工藝復(fù)雜、成本高。

目前化學磷酸化法生產(chǎn)5’-IMP也被廣泛應(yīng)用。該方法是選用適當?shù)挠袡C溶劑、POCl3和吡啶混合液，在適宜溫度下高選擇性地對核苷5’-羥基磷酸化。然而由于化學磷酸化方法所使用的溶劑量很大，其中還包括昂貴及有劇毒試劑(如POCl3)安全控制難度大、工藝要求高、生產(chǎn)成本高且在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢水嚴重污染［5］。

現(xiàn)階段酶法、化學合成法等生產(chǎn)5’-IMP均以商品化的肌苷為底物進行，該過程無疑增大了生產(chǎn)成本且商品化肌苷常經(jīng)過一系列化學修飾處理，生物源親和性不及微生物細胞自身代謝產(chǎn)生的肌苷。酶法催化雖具有大量優(yōu)點，但相對于直接發(fā)酵法生產(chǎn)5’-IMP，增加了處理發(fā)酵液、收集酶源細胞等大量工作。因此，如何將發(fā)酵產(chǎn)生的肌苷低成本、高選擇性、高轉(zhuǎn)化率地轉(zhuǎn)化為肌苷酸成為了5’-IMP生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵問題。

本文在研究來源于摩氏摩根菌Morganella morganii的酸性磷酸酶AP/PTaseM催化條件基礎(chǔ)上，將該酶編碼基因phoCYM克隆至肌苷生產(chǎn)菌株Bacillus subtilis JG，根據(jù)重組菌株合成肌苷和酸性磷酸酶特性通過調(diào)控發(fā)酵條件實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌二步發(fā)酵法生產(chǎn)5’-IMP。本文可為5’-IMP及其他核苷酸的生產(chǎn)提供了新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

表1為本研究所用菌株及質(zhì)粒。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains in this study

1.2 引物

表2為本研究所用引物，均由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers in this study

1.3 主要試劑和儀器

Solution I連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI，大連寶生物工程有限公司;Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司;1 kb DNA marker，F(xiàn)ermentas公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司;引物合成與基因測序，蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司;電穿孔儀，Eppendorf公司;高效液相色譜系統(tǒng)，美國安捷倫公司。

1.4 感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)制備、載體連接及連接體系轉(zhuǎn)化均按照相關(guān)試劑盒說明書進行操作?？莶菅挎邨U菌感受態(tài)的制備參見參考文獻［9］。

1.5 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10，酵母粉5.0，蛋白胨10，氨芐青霉素100 mg。

B.subtilis搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母浸膏15，玉米漿 12，尿素 2.0，NaCl 2.5，卡那霉素50 mg。

B.subtilis發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100，酵母浸出粉 16，(NH4)2SO422，MgSO4·7H2O 5.0，KH2PO45.0，卡那霉素 50 mg。

1.6 培養(yǎng)方法

1.6.1 E.coli誘導(dǎo)培養(yǎng)條件

按1%接種量將搖管培養(yǎng)的菌液接種于100 mL搖瓶中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.6.2 B.subtilis發(fā)酵生產(chǎn)肌苷培養(yǎng)條件

斜面活化培養(yǎng):取單菌落劃線接種于活化斜面，32℃培養(yǎng)20～24 h。

種子培養(yǎng):用接種環(huán)從第3代活化斜面上挑取2環(huán)菌于30 mL種子培養(yǎng)基中(9層紗布封口)，32℃140 r/min振蕩培養(yǎng)7～10 h。

搖瓶分批發(fā)酵培養(yǎng):按10%接種量取3 mL種子培養(yǎng)液接入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(9層紗布封口)，0～18 h:32℃，200 r/min;18～30 h:34℃，200 r/min;30～68 h:36℃，200 r/min，全程用氨水控制pH 6.4。

1.6.3 二步發(fā)酵法實驗操作流程

利用方法1.6.2對B.subtilis JAB和B.subtilis JAF進行發(fā)酵培養(yǎng)，積累肌苷;發(fā)酵結(jié)束用冰乙酸調(diào)節(jié)發(fā)酵體系pH至5.2，添加200 mmol/L焦磷酸鈉作為磷酸供體，35℃下進行第二步發(fā)酵催化反應(yīng)。

1.7 發(fā)酵過程參數(shù)測定

菌體生物量測定:用蒸餾水按適當倍數(shù)稀釋發(fā)酵液，采用752分光光度計測定OD600。

殘?zhí)菨舛葴y定:取發(fā)酵液1 mL，13 000 r/min離心1 min，取上清 10 μL，用去離子水稀釋至 1 000 μL，取25 μL稀釋后樣品進樣，采用SBA-40E多功能葡萄糖-谷氨酸分析儀測定葡萄糖含量。

肌苷和5’-IMP濃度測定:利用HPLC進行測定。條件:柱溫30℃，檢測波長245 nm，流動相總流量1.0 mL/min，色譜柱為 PuXiang C18柱(250 mm ×416 mm，5 μm)，流動相為 V(甲醇)∶V(磷酸鹽緩沖液)=1∶9。

1.8 大腸桿菌表達酸性磷酸酶酶學性質(zhì)分析

1.8.1 酶源細胞的制備

將菌液于4℃，5 000 r/min離心10 min后收集菌體細胞并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后重懸，調(diào)整其OD600=25，所得溶液即為酶源細胞懸浮液。

1.8.2 酶活力測定

標準酶活測定條件:反應(yīng)體系為 10 mL，100 mmol/L肌苷，200 mmol/L十水合焦磷酸鈉，0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液，2 mL酶源細胞懸浮液。反應(yīng)混合物充分混合均勻后立即置于30℃水浴恒溫振蕩器中，反應(yīng)7 h后加入250 μL 25%NaOH終止反應(yīng)。催化生成的5’-肌苷酸二鈉采用HPLC定量分析。按標準酶活測定條件配制10 mL反應(yīng)體系混合物于不同溫度或pH條件下反應(yīng)7 h后終止反應(yīng)并計算酶活，以測定酸性磷酸酶的最適反應(yīng)溫度和pH。

酶活力單位定義為:在標準酶活測定條件下，1 h催化底物肌苷生成1 mmol 5’-肌苷酸鈉所需的酶量為1個酶活力單位，即1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因序列的優(yōu)化及酶活力驗證

根據(jù)相關(guān)文獻報道［6］，以公布的phoC基因為出發(fā)序列(NCIB 10466)，根據(jù)枯草芽孢桿菌密碼子偏愛性對其密碼子進行優(yōu)化，并對兩個位點的氨基酸進行替換(G92D，I171T)［7］，切除前端信號肽，全基因合成序列phoCYM，通過BamHI和PstI連接表達載體pQE30。將獲得的重組質(zhì)粒 pQE30-phoCYM轉(zhuǎn)化入XL1-Blue中，構(gòu)建能夠表達酸性磷酸酶重組菌XL1-Blue+pQE30-phoCYM，并通過SDS-PAGE分析目的蛋白和進行最適催化條件優(yōu)化。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。溫度及pH對酶活的影響見圖2和圖3。

由圖1可知，構(gòu)建的重組菌XL1-Blue+pQE30-phoCYM在IPTG誘導(dǎo)條件下能夠表達目的蛋白，泳道2在27.0 kDa附近有目的蛋白條帶出現(xiàn)。說明重組菌XL1-Blue+pQE30-phoCYM構(gòu)建成功。

圖1 E.coli XL1-Blue+pQE30-phoCYM蛋白電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression proteins of E.coli XL1-Blue+pQE30-phoCYM

溫度和pH是酶催化反應(yīng)過程中的重要影響因素。由圖2和圖3可知，酸性磷酸酶催化生成5’-IMP的最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH為5.2。

圖2 溫度對全細胞催化的影響Fig.2 Effect of temperature on whole-cell catalysis

圖3 pH對全細胞催化的影響Fig.3 Effect of pH on whole-cell catalysis

2.2 重組質(zhì)粒pBE43-phoCYAM及pBSA43-phoCY -CM的構(gòu)建

pBE43及pBSA43均含有強轉(zhuǎn)錄能力的P43啟動子，且P43啟動子是一種組成型啟動子，外源蛋白基因在質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)錄無需誘導(dǎo)。pBSA43與pBE43的最大區(qū)別在于前者有一段sacB信號肽序列，為分泌型表達載體，后者為胞內(nèi)型表達載體。

根據(jù)phoCYM序列，采用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計引物，以質(zhì)粒pQE30-phoCYM為模板，分別P1-P3，P2-P3為引物獲得目的片段phoCYAM和phoCYCM。將獲得的目的片段連接質(zhì)粒pMD19-TS，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBE43-phoCYAM和pBSA43-phoCYCM。以pBE43-phoCYAM為例，構(gòu)建步驟簡圖如圖4所示。

圖4 重組質(zhì)粒pBE43-phoCYAM構(gòu)建圖Fig.4 Construction of recombinant plasmid pBE43-phoCYAM

2.3 重組菌B.subtilis JAB和B.subtilis JAF的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pBE43-phoCYAM和pBSA43-phoCYCM分別電轉(zhuǎn)化入B.subtilis JG中，用終濃度5 μg/mL卡那霉素LB抗性平板進行陽性克隆子的篩選，鑒定引物為P4，P5。對獲得的陽性克隆子進行酶切驗證。驗證結(jié)果如圖5所示。

圖5 重組質(zhì)粒pBE43-phoCYAM(a)和pBSA43-phoCYCM(b)酶切驗證Fig.5 Identification of recombinant plasmids pBE43-phoCYAM(a)and pBSA43-phoCYCM(b)by digestion

由酶切結(jié)果可知，重組菌B.subtilis JG+pBE43-phoCYAM，B.subtilis JG+pBSA43-phoCYCM構(gòu)建成功，分別命名簡稱為B.subtilis JAB和B.subtilis JAF。

2.4 重組菌B.subtilis JAB和B.subtilis JAF蛋白電泳分析

通過SDS-PAGE蛋白電泳分析驗證了AP/PTaseM在重組菌內(nèi)的表達情況。結(jié)果如圖6所示，與空白對照B.subtilis JG+pBE43(泳道1)相比較，重組菌B.subtilis JG+pBE43-phoCYAM(泳道2)在20.1～29.0 kDa處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，與目的基因編碼AP/PTaseM的蛋白分子質(zhì)量理論值27.0 kDa接近，說明重組菌B.subtilis JG+pBE43-phoCYAM構(gòu)建成功。同上，重組菌B.subtilis JG+pBSA43-phoCYCM與空白對照菌 B.subtilis JG+pBSA43(泳道 3)相比較，在20.1～29.0 kDa處出現(xiàn)較明顯蛋白條帶(泳道4)，與理論值27.0 kDa接近，說明重組菌B.subtilis JG+pBSA43-phoCYCM構(gòu)建成功。綜上所述 AP/PTaseM在兩株重組菌內(nèi)成功表達。

圖6 B.subtilis重組菌蛋白電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression proteins in all recombinant B.subtilis

2.5 B.subtilis重組菌二步發(fā)酵法生產(chǎn)5’-IMP驗證

肌苷發(fā)酵條件為32～36℃、pH 6.4，而酸性磷酸酶AP/PTaseM催化肌苷生成5’-IMP最適反應(yīng)條件為35℃，pH 5.2，因此，采用二步法進行5’-IMP的生產(chǎn)，即先在肌苷發(fā)酵條件下發(fā)酵，待肌苷產(chǎn)量和酸性磷酸酶活力達到最高值時，投入底物焦磷酸鈉并調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至5.2，溫度降至35℃，使肌苷轉(zhuǎn)化為5’-IMP。

為確定兩個階段最佳轉(zhuǎn)換時刻，分別將B.subtilis JAB和B.subtilis JAF發(fā)酵培養(yǎng)72 h并間隔取樣測定肌苷產(chǎn)量、酸性磷酸酶活性以及生物量。結(jié)果如圖7和圖8所示，二者生物量均隨著發(fā)酵時間的延長而增加;發(fā)酵60 h時，B.subtilis JAB的肌苷產(chǎn)量(14.7 g/L)和相對酶活均達到最高值;發(fā)酵54 h時，B.subtilis JAF相對酶活達到最高，后續(xù)發(fā)酵過程中酶活為92%～94%，60～72 h時，肌苷含量達到最高值(15.5 g/L)。

圖7 B.subtilis JAB發(fā)酵過程曲線Fig.7 Fermentation process of B.subtilis JAB

圖8 B.subtilis JAF發(fā)酵過程曲線Fig.8 Fermentation process of B.subtilis JAF

因此，選定60 h為兩個階段最佳轉(zhuǎn)換時間點，以分別利用 B.subtilis JG，B.subtilis JG+pBE43，B.subtilis JG+pBSA43，B.subtilis JAB 及 B.subtilis JAF進行二步法發(fā)酵生產(chǎn)5’-IMP并測定5’-IMP產(chǎn)量、肌苷殘留量。結(jié)果如圖9所示，5株菌株均能夠生成5’-IMP，盡管 B.subtilis JG，B.subtilis JG+pBE43和B.subtilis JG+pBSA43無酸性磷酸酶編碼基因，但5’-IMP為肌苷的前體物，因此有 5’-IMP生成。B.subtilis JAB和B.subtilis JAF的5’-IMP產(chǎn)量約為3株對照菌株的近2倍。B.subtilis JAF較 B.subtilis JAB提高了25.96%，可能原因是JAF分泌表達了AP/PTaseM，與胞內(nèi)表達AP/PTaseM相比，前者增加了與發(fā)酵液中肌苷的結(jié)合［8］，從而能夠轉(zhuǎn)化生成更多5’-IMP。

圖9 不同枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)肌苷和5’-IMP的比較Fig.9 Production of inosine and 5’-IMP with different B.subtilis strains

盡管JAB，JAF能夠有效積累5’-IMP，但其產(chǎn)量較低(分別為2.4 g/L和3.0 g/L)，其原因可能是:(1)B.subtilis JG菌株的5’-核苷磷酸酶活性較強，使得合成的5’-IMP去磷酸化生成肌苷;(2)JAB，JAF在發(fā)酵條件下表達的酸性磷酸酶AP/PTaseM與常規(guī)培養(yǎng)條件下獲得的酶源細胞酶活較低，直接影響了5’-IMP的轉(zhuǎn)化高效率;(3)發(fā)酵液環(huán)境中的復(fù)雜成分(如離子等)影響酶的催化效率，從而導(dǎo)致5’-IMP產(chǎn)量偏低。

3 結(jié)論

本文在獲得酶催化最適條件的基礎(chǔ)上，首次提出了枯草芽孢桿菌二步發(fā)酵法生產(chǎn)5’-IMP，結(jié)果表明利用肌苷生產(chǎn)菌表達的酸性磷酸酶能夠?qū)⑽⑸镒陨矸e累產(chǎn)生的肌苷轉(zhuǎn)化生成5’-IMP。在后續(xù)研究過程中，可對其二步發(fā)酵法工藝進行進一步的研究和優(yōu)化，提高5’-IMP產(chǎn)量。

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