富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響*1

李　晨　呂晨曦　龐　力　吳　磊

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安　271000；2. 泰山學(xué)院，山東 泰安　271000)

富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響*1

李晨1呂晨曦1龐力1吳磊2

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271000；2. 泰山學(xué)院，山東 泰安271000)

摘要：目的探討富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響。方法成年雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。重復(fù)運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物模型構(gòu)建：大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行下坡跑，速度18 m/min，坡度-16度，大強(qiáng)度重復(fù)運(yùn)動(dòng)(力竭運(yùn)動(dòng))。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)前30min與運(yùn)動(dòng)后即刻口服各10ml體重富氫水；對(duì)照組相同時(shí)間口服同劑量生理鹽水)，進(jìn)行同樣的重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)，在同一時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組在大強(qiáng)度重復(fù)運(yùn)動(dòng)(力竭運(yùn)動(dòng))后取股四頭肌，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行治療量富氫水喂養(yǎng)，考察富氫水對(duì)重復(fù)運(yùn)動(dòng)下大鼠骨骼肌微損傷氧化應(yīng)激損傷的影響作用，觀察對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(重復(fù)運(yùn)動(dòng))下大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行研究。結(jié)果補(bǔ)充富氫水后重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變異研究表明：利用透射電鏡對(duì)補(bǔ)充富氫水后大鼠進(jìn)行相同的重復(fù)運(yùn)動(dòng)(力竭運(yùn)動(dòng))后，該過(guò)程中骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化程度看出大鼠股四頭肌的微損傷有顯著改善，但是仍表現(xiàn)為肌原纖維排列不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細(xì)，肌絲卷曲等。結(jié)論大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下骨骼肌超微結(jié)構(gòu)圖譜變異與骨骼肌微損傷或者疲勞存在一定的適應(yīng)性機(jī)制，同時(shí)對(duì)補(bǔ)充富氫水過(guò)程中可帶來(lái)一定的修復(fù)機(jī)制，富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：富氫水； 重復(fù)運(yùn)動(dòng)；骨骼?。谎趸瘧?yīng)激損傷；

競(jìng)技體育發(fā)展到今天，競(jìng)爭(zhēng)日趨白熱化。重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練成為必要手段，由此產(chǎn)生的機(jī)體疲勞、組織損傷則如影隨形，成為嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)員身體健康、競(jìng)技能力與運(yùn)動(dòng)壽命的關(guān)鍵因素。因此，如何減輕運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷的程度，提高運(yùn)動(dòng)能力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)壽命成為亟待解決的問(wèn)題。我們的研究旨在揭示富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌微損傷的運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)及損傷機(jī)制，為今后提高運(yùn)動(dòng)機(jī)體疲勞消除及防護(hù)機(jī)制打下良好基礎(chǔ)并提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1一般資料

動(dòng)物模型構(gòu)建及分組：成年雄性SD大鼠100只(購(gòu)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)照組(分為5組，每組10只)：重復(fù)運(yùn)動(dòng)后即刻(B0)、重復(fù)運(yùn)動(dòng)后48小時(shí)(B48)、重復(fù)運(yùn)動(dòng)后運(yùn)動(dòng)168 h(B168)，共5個(gè)觀測(cè)時(shí)點(diǎn)。重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)組50只，分組及觀測(cè)時(shí)點(diǎn)同對(duì)照組。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠2只，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)噬齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，動(dòng)物室內(nèi)溫度22±3 ℃，相對(duì)濕度為50±5%，光照時(shí)間為8∶00～18∶00。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均未進(jìn)行過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方案

氫氣飽和生理鹽水的氫氣濃度保持在2%左右。經(jīng)r射線消毒滅菌，無(wú)死腔地裝于鋁袋中常壓4℃保存。實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)前30 min與運(yùn)動(dòng)后即刻口服各10 ml體重富氫水；對(duì)照組相同時(shí)間口服同劑量生理鹽水。

1.2.1重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物造模大鼠在動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行下坡跑，速度18 m/min，坡度16 °，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30 min后休息5 min，再運(yùn)動(dòng)30 min。運(yùn)動(dòng)時(shí)間共60 min。運(yùn)動(dòng)1周后，再按照上次運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行一次重復(fù)運(yùn)1.2動(dòng)。分別在重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后即刻、48 h、168 h(3個(gè)時(shí)點(diǎn))用頸椎脫臼法處死，在股四頭肌上取大、小兩塊肌肉，小塊肌肉迅速切成米粒大小的組織塊，取材后放入濃度為3.5%的戊二醛固定液中固定過(guò)夜(備電鏡觀察)。

1.2.2電鏡標(biāo)本及切片制作電鏡標(biāo)本用0.1M pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每隔20 min沖洗一次。用1%的鋨酸(四氧化鋨)再固定4 h后，再用0.1M、pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每20 min一次。用梯度乙醇脫水(30%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇)每步時(shí)間為30 min，再用環(huán)氧丙烷過(guò)渡兩次，每次2 h。使用Epon812樹(shù)脂浸透，包埋，聚合。使用LKB超薄切片機(jī)進(jìn)行超波切片，用醋酸鈾——檸檬酸鉛雙染色。制成的電鏡切片使用美國(guó)GE公司生產(chǎn)的透射電鏡進(jìn)行觀察，并拍照。

1.2.3指標(biāo)觀察電鏡下觀察(1)骨骼肌的粗、細(xì)兩種肌絲、位于肌節(jié)的A帶、M線、Z線、H帶、I帶、A帶；(2)、橫小管：是肌膜向肌漿內(nèi)凹陷形成的小管網(wǎng)，橫小管可將肌膜的興奮迅速傳到每個(gè)肌節(jié)。(3)線粒體(mitochondrion)：粒體為線狀、長(zhǎng)桿狀、卵圓形或圓形小體，外被雙層界膜。(4)細(xì)胞核：主要看核膜厚度、基質(zhì)電子密度高低、有無(wú)核邊集現(xiàn)象。同一觀察組進(jìn)行光鏡檢查對(duì)照。

1.2.4觀察富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響，研究富氫水在重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)骨骼肌微損傷的運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)修復(fù)機(jī)制及抗疲勞效果，進(jìn)一步確定運(yùn)動(dòng)負(fù)荷與最適注射富氫水劑量、時(shí)間奠定基礎(chǔ)。然后，選用氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物3-NT、MDA與8-OHdG這3個(gè)指標(biāo)分別從蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、DNA損傷三方面，觀察富氫水對(duì)重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響。

1.3實(shí)驗(yàn)對(duì)象及實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)對(duì)象依據(jù)大白鼠為研究對(duì)象，針對(duì)重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)下大鼠骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，觀察重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，以及觀察氧化損傷的具體參數(shù)。

1.3.1一次離心運(yùn)動(dòng)及重復(fù)運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物模型構(gòu)建通過(guò)電鏡下觀察一次離心運(yùn)動(dòng)以及重復(fù)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌(股四頭肌、樹(shù)脊肌)損傷程度研究，進(jìn)一步確定骨骼肌損傷可靠樣本，確定運(yùn)動(dòng)損傷肌肉的取樣時(shí)間點(diǎn)。

1.3.2一次離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化研究利用下坡跑大鼠模型，運(yùn)動(dòng)損傷后骨骼肌進(jìn)行取樣，常溫下5%戊二醛保存，備檢。

1.3.3重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化研究利用相同模型對(duì)一次離心運(yùn)動(dòng)后的大鼠進(jìn)行重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)，研究實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組模型骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異(取樣同上)。所有標(biāo)本在GE透射電鏡下觀察，檢查結(jié)果分別與同種模型的正常骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行比較，觀察存在的差異。

1.3.4重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌氧化損傷的研究重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)后大鼠在觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，選擇同一模型血清測(cè)定氧化標(biāo)記物的變化。

2結(jié)果

電鏡結(jié)果對(duì)照組運(yùn)動(dòng)前30min與運(yùn)動(dòng)后即刻口服各10 ml體重生理鹽水(圖1)顯示未受到任何損傷的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)。①重復(fù)運(yùn)動(dòng)即刻AO組(圖1)顯示正常肌節(jié)、線粒體；②重復(fù)運(yùn)動(dòng)后48h(圖2)：肌細(xì)胞機(jī)能開(kāi)始恢復(fù)，線粒體雖然仍有受到損傷的跡象，但已可以看出正在開(kāi)始逐漸恢復(fù)。③重復(fù)運(yùn)動(dòng)后168h(圖3)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、線粒體數(shù)量初步恢復(fù)，但不明顯。

實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)前30min與運(yùn)動(dòng)后即刻口服各10ml體重富氫水。①重復(fù)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組即刻B0組(圖7)：僅出現(xiàn)線粒體數(shù)量較少的現(xiàn)象，同時(shí)有少部分肌節(jié)被拉長(zhǎng)，產(chǎn)生變化；②重復(fù)運(yùn)動(dòng)后48h(圖9)：肌節(jié)I帶變長(zhǎng)，線粒體的空泡化現(xiàn)象出現(xiàn)，相比較A組，本組的現(xiàn)象細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯，部分肌節(jié)被拉長(zhǎng)；③重復(fù)運(yùn)動(dòng)后168h(圖11、12)：骨骼肌超微結(jié)構(gòu)得到充分修復(fù)及得到保護(hù)，但是仍表現(xiàn)為肌原纖維排列不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細(xì)，肌絲卷曲等表現(xiàn)。

圖1　AO：肌節(jié)、線粒體基本正常

圖2　AO：肌節(jié)、線粒體變化不大(×25000)

圖3　A48：線粒體雖然仍有受到損傷的跡象，

圖4　A48：同左，線粒體結(jié)構(gòu)逐漸清晰。

圖5　A168:結(jié)果同前一張(x10000)

圖6　A168:線粒體結(jié)構(gòu)逐漸清晰(x25000)

圖7

圖8

圖7~8B0：線粒體變化并不大，僅僅出現(xiàn)線粒體數(shù)量較少的現(xiàn)象，同時(shí)有少部分肌節(jié)被拉長(zhǎng)，產(chǎn)生變化。

圖9

圖10

圖9~10B48：肌節(jié)I帶變長(zhǎng)，線粒體的空泡化現(xiàn)象出現(xiàn)，相比較A組，本組的現(xiàn)象類似恢復(fù)延遲，部分肌節(jié)被拉長(zhǎng)。

圖11

圖12

圖11~12B168：大鼠股四頭肌的超微結(jié)構(gòu)雖然與訓(xùn)練后即刻組和訓(xùn)練后24 h、48h組相比，有顯著改善，但是仍表現(xiàn)為肌原纖維排列不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細(xì)，肌絲卷曲，肌漿網(wǎng)腫脹等。(左 x10000; 右x25000)

研究結(jié)果顯示重復(fù)性力竭離心運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。損傷變化主要表現(xiàn)為：運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌細(xì)胞膜發(fā)生局部模糊、溶解，肌纖維間嵴有缺損，核膜皺縮，肌細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性改變。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，至運(yùn)動(dòng)后48h損傷程度最重，出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、扭曲，肌細(xì)胞膜溶解，Z線紊亂呈鋸齒狀，且部分消失，線粒體空泡變性改變加重。運(yùn)動(dòng)后168h，肌纖維排列基本正常，細(xì)胞膜部分皺縮，核膜間隙局部擴(kuò)張，未見(jiàn)肌纖維水腫，Z線明暗帶、M線均可分清。實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)前30min與運(yùn)動(dòng)后即刻口服各10ml富氫水骨骼肌超微結(jié)構(gòu)修復(fù)明顯，隨著時(shí)間推移有顯著改善，由此得出富氫水對(duì)重復(fù)大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的具有保護(hù)作用。

3結(jié)論

3.1離心運(yùn)動(dòng)所致的骨骼肌微損傷具有一定的延遲現(xiàn)象，在1次離心運(yùn)動(dòng)后即刻，骨骼肌微損傷在電鏡下觀察變化輕微，但在運(yùn)動(dòng)后48 h超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著的損傷性變化，而運(yùn)動(dòng)后48 h骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)可以逐漸適應(yīng)性恢復(fù)，骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著的適應(yīng)性恢復(fù)。

3.2富氫水重復(fù)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組透射電鏡觀察大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)在口服富氫水后具有對(duì)骨骼肌微損傷修復(fù)防護(hù)作用。

3.2.1電鏡下直接觀察到運(yùn)動(dòng)后骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)的變化。

3.2.2重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)可以對(duì)骨骼肌肌纖維損傷產(chǎn)生一定的累加作用。

3.3超微結(jié)構(gòu)顯示，運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)骨骼肌結(jié)構(gòu)的損傷性變化，但是，B組較A組在同一時(shí)間點(diǎn)損傷減輕，提示：運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷未必是一種完全的病理過(guò)程，可能是骨骼肌適應(yīng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激的一個(gè)介于生理與病理的中間過(guò)程。其機(jī)理可能是口服富氫水后經(jīng)過(guò)力竭性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練損傷修復(fù)后的肌肉增強(qiáng)了抗損傷能力的結(jié)果。

3.4重復(fù)離心運(yùn)動(dòng)確實(shí)存在骨骼肌微損傷現(xiàn)象，并且骨骼肌超微結(jié)構(gòu)存在運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)以及運(yùn)動(dòng)性損傷的疊加效應(yīng)[1][2]。

3.5值得進(jìn)一步研究的題目

3.5.1離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化不一定是一種完全的病理過(guò)程，是否是肌節(jié)的主動(dòng)適應(yīng)過(guò)程，有待進(jìn)一步研究。

3.5.2骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化與基質(zhì)、肌膜結(jié)構(gòu)的關(guān)系，有待進(jìn)一步論證。

3.5.3肌節(jié)恢復(fù)、重塑過(guò)程是否需要炎癥因子參與(有學(xué)者報(bào)道：運(yùn)動(dòng)后血液中與炎癥反應(yīng)有關(guān)的蛋白、如急相蛋白和炎癥過(guò)程指示物含量增加)，需進(jìn)一步探究。

總之，運(yùn)動(dòng)與骨骼肌關(guān)系的研究雖然是一個(gè)老課題，但是，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)如何再塑需要深入研究。特別是能夠延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞、減輕骨骼肌微損傷、提高競(jìng)技能力且安全有效、無(wú)毒副作用的非興奮劑物質(zhì)，對(duì)如何有效的運(yùn)動(dòng)性肌肉疲勞恢復(fù)、延遲性肌肉酸痛的消除方法的深入研究，顯得尤為重要。隨著方法學(xué)上的不斷拓展，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷仍有很大的、很深的研究?jī)r(jià)值，其研究前景十分廣闊。

參考文獻(xiàn):

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[2]董貴俊,呂晨曦,葛新發(fā),等.一次和重復(fù)大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)前后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(2):142-148.

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作者簡(jiǎn)介：李晨(1964—)，男，山東泰安人，副教授，本科，主要從事體育健康教育。

中圖分類號(hào)：R287

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2015)04-0371-05

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.004

(收稿日期2015-1-19)

Hydrogen-rich water on oxidative stress injury in rat skeletal muscle after exhaustive exercise was repeated

LIChen1LVChen-xi1PANGli1WULei2

(1. Taishan Medical College, Taian 271000, China; 2. Taishan University, Taian 271000,China)

Abstract:Objective: To investigate the hydrogen-rich water on skeletal muscle oxidative stress in rats after exhaustive exercise was repeated injury. Methods: 100 adult male SD rats were randomly divided into 2 groups: control group, the experimental group. Construction of an animal model of repetitive motion: bench rats ran downhill running, speed 18 m / min, the slope of -16 degrees, repeated high-intensity exercise (exhaustive exercise). The establishment of the experimental group (each 10ml oral immediate weight hydrogen-rich water before and after the experimental group sports and exercise 30min; the same time the control group was treated with the same dose of saline) group, and the same was repeated exhaustive exercise, respectively, at the same time control group, the experimental group were quadriceps strength after repetitive motion (exhaustive exercise), while the experimental group were treated rats fed the amount of hydrogen-rich water to investigate hydrogen-rich water damage in rat skeletal muscle micro-oxidation under repetitive motion the influence of stress injury observed in the control group, the experimental group of high-intensity exercise (repetitive motion) in rat skeletal muscle ultrastructure variation research. Variability of the results of rat skeletal muscle ultrastructure complementary hydrogen-rich water after repeated studies have shown that exercise training: the use of transmission electron microscopy after complementary hydrogen-rich water rats subjected to the same repetitive motion (exhaustive exercise), the skeletal muscle in the process over the extent of structural changes in the micro-micro quadriceps injury in rats seen a significant improvement, but still showed myofibrils irregular, incomplete sarcomere, Z thinning, muscle wire curling. Patterns of variation in skeletal muscle ultrastructure and skeletal muscle damage or fatigue micro-adaptive mechanisms exist certain conclusions high intensity exercise, while the complementary process of hydrogen-rich water can bring certain repair mechanisms, hydrogen-rich water sports on repeat Exhaustive oxidative stress in rat skeletal muscle injury in rats.

Key words:hydrogen-rich water; repetitive motion; skeletal muscle; oxidative stress