壬基酚對卵巢癌細胞HO8910增殖的影響*1

趙　輝　李曉梅　丁國永

(1. 泰安市出入境檢驗檢疫局，山東 泰安　271000； 2. 泰山醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東 泰安　271016)

壬基酚對卵巢癌細胞HO8910增殖的影響*1

趙輝1李曉梅2丁國永2

(1. 泰安市出入境檢驗檢疫局，山東 泰安271000； 2. 泰山醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東 泰安271016)

摘要：目的探討壬基酚對卵巢癌細胞HO8910增殖的作用。方法 HO8910細胞在有酚紅RPMI1640(含10%新生牛血清)培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，實驗前1天改為無酚紅RPMI1640(含5%CDT-FBS)中繼續(xù)培養(yǎng)，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L的NP和1×10-11mol/L的E2處理細胞24 h后，MTT法和流式細胞術(shù)檢測對HO8910細胞的增殖作用。 結(jié)果1×10-5mol/L，1×10-6mol/LNP組和E2組細胞增殖率和細胞增殖指數(shù)均有明顯增加。結(jié)論壬基酚對HO8910細胞發(fā)揮雌激素樣作用，有促進卵巢癌細胞增殖的作用。

關(guān)鍵詞：壬基酚；卵巢癌；增殖

壬基酚(nonylphenol,NP)作為高性價比的非離子表面活性劑，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程，如采礦、造紙、皮毛加工、自來水管材合成、化肥或農(nóng)藥中應用廣泛。據(jù)統(tǒng)計，我國壬基酚的年使用量約為 8萬t[1]，而工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中排放的壬基酚，在環(huán)境中不易降解，半衰期達2~3個月，可通過食物鏈在生物體內(nèi)蓄積[2]。有研究顯示：壬基酚是雌激素類內(nèi)分泌干擾物，能夠干擾機體的生殖、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)，產(chǎn)生胚胎發(fā)育、生殖、免疫和神經(jīng)毒性，具有一定的致癌性[3]。曹向可[4]等通過NP的代謝動力學研究發(fā)現(xiàn)，在機體各器官組織和血清中，以卵巢中的NP含量最高。NP在卵巢內(nèi)的蓄積是否發(fā)揮了雌激素樣作用，影響了卵巢相關(guān)疾病如卵巢癌的發(fā)病風險。本研究以NP為研究對象，探討了NP的雌激素樣作用及其對卵巢癌細胞的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1卵巢癌細胞株HO8910購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2試劑RPMI1640培養(yǎng)基(有酚紅和無酚紅)活性炭—葡聚糖苷處理過的胎牛血清(CDT-FBS，origin: Newsland),新生牛血清，MTT，DMSO(杭州四季青生物工程材料有限公司)，雌二醇(estradiol,E2)，壬基酚(nonylphenol, NP，sigma)(SIGMA)。

1.1.3儀器CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，倒置式生物顯微鏡，多功能酶聯(lián)免疫檢測儀，流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)方法采用開放式單層貼壁培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)液為有酚紅RPMI1640(含10%新生牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度每2 d～3 d換一次液(或細胞傳代)。加受試物前用PBS洗滌細胞，改為在無酚紅RPMI1640(含5%CDT-FBS)中繼續(xù)培養(yǎng)1 d，耗盡細胞內(nèi)儲存的雌激素。

1.2.2 實驗分組壬基酚、雌二醇用無水乙醇溶解后加入無酚紅的RPMI1640(含5%CDT-FBS)培養(yǎng)液中，各組終濃度如下：①溶劑對照組無水乙醇：體積含量比為0.1%。②壬基酚實驗組 :1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L。③陽性對照組：雌二醇1×10-11mol/L。

1.2.3 樣本處理和指標檢測(1) MTT檢測細胞增殖 將經(jīng)無酚紅RPMI1640(含5%CDT-FBS)培養(yǎng)1 d的HO8910細胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104個/孔)，培養(yǎng)箱里靜置12 h，待細胞貼壁后加入各種處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)，每一劑量組設(shè)4個平行孔。 24 h時，鏡下觀察細胞數(shù)量及形態(tài)。加入MTT(5 mg/ml,20 μl/孔),繼續(xù)孵育4 h,棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO150μl,以DMSO調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀以490 nm波長測定各孔吸光值(A490)。計算增殖率：增殖率=(實驗組A490均值—對照組A490均值)/對照組A490均值×100%。(2)流式細胞術(shù)分析細胞周期的變化：將經(jīng)無酚紅RPMI1640(含5%CDT-FBS)培養(yǎng)1 d的HO8910細胞接種于6孔培養(yǎng)板，前處理如上，加藥24 h去掉培養(yǎng)液，胰酶消化后制成單細胞懸液，用預冷的PBS重懸細胞，加入-20℃預冷的無水乙醇，調(diào)整其終濃度為75%，-20℃放置過夜固定。用預冷的PBS重懸固定后的細胞以去除乙醇，加入PI工作液(10 mg/ml,400 μl/管)，避光染色30 min，上流式細胞儀檢測，計算細胞增殖指數(shù)。

1.3統(tǒng)計分析方法采用SPSS20.0對結(jié)果進行分析，定量資料多組均數(shù)的比較用方差分析，多實驗組與一個對照組的比較用DUNNET-T檢驗。定性資料的比較用卡方檢驗，多組率兩兩比較時P<0.125為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學改變 陰性對照組細胞生長緩慢，有些細胞皺縮變小細胞凋亡，細胞出現(xiàn)死亡。而NP實驗組與E2組細胞生長狀況良好，并大量增殖，細胞之間的聯(lián)系比較的緊密，形狀變得不規(guī)則，呈多邊形，梭狀等。

圖1　陰性對照組

圖2　NP組

圖3　E2組

2.2 MTT法檢測結(jié)果與陰性對照組比較，NP各處理組與E2組的吸光度均有顯著差異。結(jié)果見表1。

表1　MTT法檢測NP對HO8910細胞增殖的影響

*：與陰性對照組比較P<0.05，△：與E2組比較，P<0.05

2.3流式結(jié)果 與陰性對照組比較，1×10-7組的細胞增殖指數(shù)較低，其它各處理組和E2組的細胞增殖指數(shù)均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2　NP對HO8910細胞增殖周期的影響

*與溶劑對照組比較P<0.0125。

3 討論

卵巢的癌變是一種常見且惡性程度較高的雌激素依賴性腫瘤，發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第3位，病死率高，嚴重危害廣大婦女的健康。近年來，我國卵巢癌的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢[5]，有文獻報道長期接觸環(huán)境雌激素可增加患卵巢癌的危險性[6]。因此，本研究選取了環(huán)境中存在較多的環(huán)境雌激素樣物質(zhì)壬基酚，探討它對卵巢癌細胞株HO8910增殖的影響。實驗結(jié)果顯示：同E2一樣，壬基酚促進了HO8910細胞的增殖和細胞DNA的合成，細胞增殖指數(shù)增加，其效應呈現(xiàn)量效關(guān)系，以1×10-5mol/L最強。目前，關(guān)于壬基酚致癌作用有一些報道，但與卵巢癌的關(guān)系研究不多，本次研究結(jié)果可為壬基酚與卵巢癌的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時也可為卵巢癌的病因預防提供方向。

參考文獻：

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[2]呂曉華，古燕，宋艷. 壬基酚對紅鯽、草魚和鰱魚的毒性及組織蓄積研究[J].衛(wèi)生研究，2012，41(5)：785-789.

[3]譚艷芳，陳鋒.環(huán)境雌激素與激素相關(guān)腫瘤研究進展[J]. 實用預防醫(yī)學，2011，18(1)：189-192.

[4] 曹向可，錢慶增，董靜，等. 壬基酚在雌性大鼠體內(nèi)的分布與清除[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2010,37(23):4418-4419.

[5]丁萍飛，張鑫培，方海平，等. 2000~2009年浙江省腫瘤登記地區(qū)卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J]. 中國腫瘤，2014(3)：192-195.

[6]Salehi F，Dunfield L，Phillios KP，et al. Risk factors for ovarian cancer: an overview with emphasis on hormonal factors[J]. Toxical Environment Health B Crit Rev,2008,11:301-321.

基金項目：泰安市科技發(fā)展計劃項目(20103003)；山東省高?？萍加媱濏椖?J10LF85)。

作者簡介：趙輝(1977—)，男，山東牟平人，主治醫(yī)師，研究方向：疾病病因研究。通訊作者：李曉梅(1977—)女，山東乳山人，副教授，研究方向：病因流行病學研究。E-mail:xmli@tsmc.edu.cn。

中圖分類號：R730

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7115(2015)04-0361-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.001

(收稿日期2015-1-16)

Effect of nonylphenol on ovarian cancer HO8910 cell proliferation

ZHAOHui1LIXiao-mei2DINGGuo-yong2

(1. Taian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Taian 271000，China； 2. The Public Health Institute of Taishan Medical University，Taian 271016，China)

Abstract:Objective: To investigate the effect of nonylphenol on ovarian cancer HO8910 cells proliferation. Method: HO8910 cells was maintained in RPMI1640 medium with 10%neonatal bowine serum. 1d before the beginning of the experiment ,the cells were be seeded in phenol red-free 1640 medium containing 5%charcoal dextran-treated FBS, after 1×10-5mol/L，1×10-6mol/L and 1×10-7mol/L of NP and 1×10-7mol/L E2treatment for 24 h, the proliferation of HP8910 was analyzed by MTT and flow sytometer. Results: Cell proliferation rate and Cell proliferation index increased significantly in 1×10-5mol/L，1×10-6mol/LNP groups and E2group. Conclusion: NP produce similar effects on HO8910 with E2, maybe promote the proliferation ovarian cancer cell.

Key words:nonylphenol; ovarian cancer; proliferation