特發(fā)性肺纖維化患者外周血Th17細(xì)胞變化及其臨床意義

史紅陽，劉 昀，方 萍，張德信(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004;通訊作者，E-mail:shihy2003@126．com)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因未明的肺間質(zhì)性疾病，主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺間質(zhì)纖維化，其病理改變以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積并伴有炎癥和組織損傷所致的結(jié)構(gòu)破壞為特征，病變局限于肺部，引起彌漫性肺纖維化，導(dǎo)致肺功能損害和呼吸困難。目前缺乏特效治療手段，主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑治療，預(yù)后很差，經(jīng)過數(shù)月至數(shù)年發(fā)展為呼吸衰竭和肺心病，起病后平均存活時(shí)間為2．8-3．6年。發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素、病毒感染、特異質(zhì)、環(huán)境因素、自身免疫等因素都與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病有關(guān)，其中感染和自身免疫發(fā)揮了重要的作用［1-4］。Th17細(xì)胞是在研究自身免疫性疾病過程中逐漸發(fā)現(xiàn)的一類Th細(xì)胞亞群，目前普遍認(rèn)為Th17細(xì)胞是一種獨(dú)立的細(xì)胞亞群，在炎癥、自身免疫病、腫瘤、移植免疫等過程中發(fā)揮重要作用［5-7］。國內(nèi)外學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺纖維化動(dòng)物模型肺組織中Th17細(xì)胞數(shù)量及外周血中IL-17水平明顯增高，提示Th17細(xì)胞及IL-17可能在肺纖維化發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用［8-17］。RORγt是視黃醇家族成員之一，研究表明RORγt是Th17細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子。RORγt缺陷小鼠的CD4+胸腺細(xì)胞數(shù)量均減少，缺乏淋巴結(jié)、集合淋巴濾泡和淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞，Th17細(xì)胞分化被抑制，發(fā)生實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)等自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度減輕。同時(shí)，過表達(dá) RORγt促進(jìn)了 IL-17的合成［18］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特發(fā)性肺纖維化患者外周血Th17細(xì)胞百分率、RORγt mRNA表達(dá)水平及血漿中IL-17的水平，初步探討Th17細(xì)胞在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中的作用，進(jìn)而為特發(fā)性肺纖維化的臨床早期診斷和治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象

選取2014-01～2014-12在我院呼吸內(nèi)科住院確診的特發(fā)性肺纖維化患者38例，其中男性25例，女性13例，年齡36-71歲，平均年齡(59．6±11．7)歲。所有病例診斷均符合2011年美國胸科協(xié)會(huì)(ATS)、歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ERS)、日本呼吸學(xué)會(huì)(JRS)和拉丁美洲胸科學(xué)會(huì)(ALAT)共同推薦的IPF診治共識(shí)中的IPF診斷標(biāo)準(zhǔn)［19］。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他已知原因?qū)е碌姆卫w維化(包括家庭、職業(yè)環(huán)境暴露相關(guān)的肺纖維化、結(jié)締組織病繼發(fā)的肺纖維化、藥物及放射相關(guān)的肺纖維化);②合并惡性腫瘤;③合并或診斷為慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺膿腫、活動(dòng)性肺結(jié)核、肺癌、結(jié)節(jié)病等;④合并嚴(yán)重的心臟、肝臟、腎臟及血液系統(tǒng)疾病;⑤近期合并感染性疾病;⑥妊娠或哺乳期婦女;⑦合并精神疾病。

選取40例同期在我院進(jìn)行健康體檢的健康者作為正常對(duì)照組，其中男性25例，女性15例，年齡38-66歲，平均年齡(55．8±10．7)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。本研究得到我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得所有研究對(duì)象的知情同意。

所有患者均在進(jìn)行糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑治療前采樣，無菌采取EDTA抗凝靜脈血5．0 ml，500×g離心10 min后分離血漿，-86℃保存，用于ELISA檢測(cè)。利用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，制備成濃度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，一部分用于流式細(xì)胞檢測(cè)，一部分用于 PCR檢測(cè)。

1．2 方法

1．2．1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞百分率:取250 μl單細(xì)胞懸液，加入佛波酯(終濃度50 ng/ml)、離子霉素(終濃度500 ng/ml)37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后加入BD GolgiPlug蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(終濃度1 μl/ml)，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。PBS洗滌后500×g 離心 5 min，棄上清液，加入 20 μl FITC-CD4 抗體，溫和混勻，常溫下避光孵育20 min。PBS洗滌后500 ×g 離心5 min，棄上清液，加入 250 μl固定/破膜液，4℃避光孵育20 min。洗滌細(xì)胞后加入20 μl Alexa Fluor?647-IL-17抗體或同型對(duì)照抗體，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。PBS洗滌細(xì)胞后重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CD4+T細(xì)胞設(shè)門進(jìn)行分析。

1．2．2 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè)RORγt mRNA的表達(dá)水平 取1．0 ml細(xì)胞懸液，500×g離心10 min，加入1．0 ml Trizol液提取細(xì)胞總 RNA，將提取的RNA用30．0 ml DEPC水溶解，-80℃保存?zhèn)溆?。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，具體如下:3．0 μl總 RNA、1．0 μl Oligo(dT)及 9．0 μl雙蒸水，混勻后70℃孵育5 min，冰上冷卻，依次加入5×反應(yīng)緩沖液 4．0 μl、20 U/μl RNase 抑制劑 1．0 μl及10 mmol/L dNTP 2．0 μl，37 ℃孵育5 min。加入200 U/μl M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，42 ℃ 孵育 60 min，70℃孵育10 min，冰上冷卻終止反應(yīng)。合成的cDNA第一鏈在-20℃保存。根據(jù)RORγt、GAPDH基因序列，利用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)，基因及引物系列、產(chǎn)物大小見表1。20 μl PCR反應(yīng)體系包括SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(10 μmol/L)各 1．0 μl、DNA 模板 2．0 μl、雙蒸水6．0 ml。兩步法PCR擴(kuò)增程序如下:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s、60℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后獲得循環(huán)閾值(CT值)，2-ΔΔCt分析目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)。ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)。

表1 基因及引物序列Table 1 Gene and primer sequence

1．2．3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血漿 IL-17水平 利用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-17水平，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 特發(fā)性肺纖維化患者外周血Th17細(xì)胞百分率的比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示特發(fā)性肺纖維化患者外周血Th17細(xì)胞百分率為(1．26±0．29)%，與正常對(duì)照組(0．95±0．21)%相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5．427，P=0．000，見圖1)。

圖1 IPF患者外周血Th17細(xì)胞百分率Figure 1 The percentage of Th17 cells in peripheral blood of patients with IPF by flow cytometry

2．2 特發(fā)性肺纖維化患者外周血RORγt mRNA及血漿IL-17水平的比較

熒光定量PCR結(jié)果顯示特發(fā)性肺纖維化患者RORγt mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照明顯增高(P＜0．05);ELISA結(jié)果顯示特發(fā)性肺纖維化患者血漿IL-17水平明顯高于正常對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，見表2)。

表2 IPF患者與正常對(duì)照組外周血RORγt mRNA及IL-17水平的比較(±s)Table 2 Comparison of RORγt mRNA and IL-17 levels between peripheral blood of patients with IPF and normal controls(±s)

表2 IPF患者與正常對(duì)照組外周血RORγt mRNA及IL-17水平的比較(±s)Table 2 Comparison of RORγt mRNA and IL-17 levels between peripheral blood of patients with IPF and normal controls(±s)

組別 n RORγt mRNA IL-17(pg/ml)40 0．41 ±0．19 23．64 ±9．51特發(fā)性肺纖維化組 38 0．67 ±0．28 41．85 ±16．27 t 4．820 6．071 P正常對(duì)照組0．000 0．000

3 討論

輔助性T細(xì)胞(help T lymohocyte，Th)在機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫防御和自穩(wěn)過程中發(fā)揮重要的作用，1986年 Mossman等［20］先發(fā)現(xiàn) CD4+T 細(xì)胞可分為兩個(gè)細(xì)胞亞群，分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞亞群和分泌IL-4的Th2細(xì)胞，隨后在研究自身免疫性疾病過程中逐漸發(fā)現(xiàn)了另一類Th細(xì)胞亞群-Th17細(xì)胞，越來越多的研究證實(shí)Th17細(xì)胞是一種獨(dú)立的細(xì)胞亞群。目前研究證實(shí)Th17細(xì)胞的分化過程需要經(jīng)過誘導(dǎo)、擴(kuò)增、穩(wěn)定/維持3個(gè)步驟，在不同的階段需要不同的細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)階段主要需要TGF-β和IL-6的共同作用，新分化的Th17細(xì)胞分泌IL-21，而IL-21可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的擴(kuò)增，隨后Th17細(xì)胞在IL-23的作用下來保持穩(wěn)定。Th17細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26(人)、CCL20 等細(xì)胞因子，其中IL-17A是最主要的效應(yīng)分子，屬于促炎癥因子，最初Th17細(xì)胞的功能是作為適應(yīng)性免疫的一個(gè)分支清除Th1和Th2細(xì)胞免疫無法處理的特定類型的病原體，革蘭氏陽性菌和真菌感染均能引起強(qiáng)烈的Th17細(xì)胞應(yīng)答，隨后的研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在炎癥、自身免疫病、腫瘤、移植免疫中發(fā)揮重要作用［5-7］。

特發(fā)性肺纖維化是一種復(fù)雜的進(jìn)行性病變，發(fā)病機(jī)制尚未清楚，炎癥反應(yīng)和自身免疫在其發(fā)病過程中的作用越來越受到重視。國外學(xué)者首先在研究肺的囊性纖維化時(shí)提出Th17、IL-17與肺纖維化有關(guān)［21］。近年來國內(nèi)外學(xué)者通過肺纖維化動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)肺組織中Th17細(xì)胞數(shù)量及外周血中IL-17水平明顯增高，提示Th17細(xì)胞及IL-17可能在肺纖維化發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用［8-17］。為了探討Th17細(xì)胞在特發(fā)性肺纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了特發(fā)性肺纖維化患者外周血中Th17細(xì)胞百分率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者外周血Th17細(xì)胞細(xì)胞百分率與正常對(duì)照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，這與國內(nèi)外學(xué)者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致［8-17］。本研究還檢測(cè)了特發(fā)性肺纖維化患者外周血中RORγt mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示特發(fā)性肺纖維化患者RORγt mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高(P＜0．05)，這與外周血中Th17細(xì)胞百分率結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了特發(fā)性肺纖維化患者外周血中Th17細(xì)胞百分率增高。由于Th17細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-17，所以Th17細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)主要是通過IL-17來發(fā)揮作用的，IL-17與其受體結(jié)合后可以誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病發(fā)病過程。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者血漿IL-17水平明顯高于于正常對(duì)照組(P＜0．05)，這也與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［10，11］。

綜上所述，特發(fā)性肺纖維化患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞數(shù)量增多，分泌IL-17也增多，Th17細(xì)胞在特發(fā)性肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮一定作用，同時(shí)IL-17以及RORγt亦可能在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。既往關(guān)于特發(fā)性肺纖維化患者外周血中Th17細(xì)胞百分率檢測(cè)的相關(guān)研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)患者血中Th17細(xì)胞百分率及RORγt mRNA水平，亦同時(shí)檢測(cè)了血漿中IL-17的水平，具有一定的創(chuàng)新性。目前，導(dǎo)致特發(fā)性肺纖維化患者Th17細(xì)胞異常的具體機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞及IL-17在特發(fā)性肺纖維化中的作用，可能為早期診斷及臨床治療特發(fā)性肺纖維化提供新的靶點(diǎn)。

［1］Wolters PJ，Collard HR，Jones KD．Pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Annu Rev Pathol，2014，9:157-179．

［2］Ryu JH，Moua T，Daniels CE，et al．Idiopathic pulmonary fibrosis:evolving concepts［J］．Mayo Clin Proc，2014，89(8):1130-1142．

［3］Antoniou KM，Margaritopoulos GA，Siafakas NM．Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis:from the past to the future［J］．Eur Respir Rev，2013，22(129):281-291．

［4］Chakraborty S，Chopra P，Ambi SV，et al．Emerging therapeutic interventions for idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Expert Opin Investig Drugs，2014，23(7):893-910．

［5］Zambrano-Zaragoza JF，Romo-Martínez EJ，de Durán-Avelar M J，et al．Th17 cells in autoimmune and infectious diseases［J］．Int J Inflam，2014，2014:651503．

［6］Wilke CM，Bishop K，F(xiàn)ox D，et al．Deciphering the role of Th17 cells in human disease［J］．Trends Immunol，2011，32(12):603-611．

［7］McDonald DR．TH17 deficiency in human disease［J］．J Allergy Clin Immunol，2012，129(6):1429-1435;

［8］Fran?ois A，Gombault A，Villeret B，et al．B cell activating factor is central to bleomycin-and IL-17-mediated experimental pulmonary fibrosis［J］．J Autoimmun，2015，56:1-11．

［9］Fabro AT，da Silva PH，Zocolaro WS，et al．The Th17 pathway in the peripheral lung microenvironment interacts with expression of collagen V in the late state of experimental pulmonary fibrosis［J］．Immunobiology，2015，220(1):124-135．

［10］Chen Y，Li C，Weng D，et al．Neutralization of interleukin-17A delays progression of silica-induced lung inflammation and fibrosis in C57BL/6 mice［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2014，275(1):62-72．

［11］Tan HL，Rosenthal M．IL-17 in lung disease:friend or foe［J］．Thorax，2013，68(8):788-790．

［12］Song L，Weng D，Liu F，et al．Tregs promote the differentiation of Th17 cells in silica-induced lung fibrosis in mice［J］．PLoS One，2012，7(5):e37286．

［13］Dong Z，Tai W，Yang Y，et al．The role of all-trans retinoic acid in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］．Exp Lung Res，2012，38(2):82-89．

［14］賴小映，鐘小寧．Th17、Treg在肺纖維化小鼠外周血、肺組織中的表達(dá)及意義［J］．山東醫(yī)藥，2013，53(19):1-4．

［15］萬勇，張念，李劍平，等．調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞的失衡及其對(duì)大鼠肺纖維化的影響［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，42(2):161-167．

［16］李樹民，鮑文華，穆曉春，等．Th17細(xì)胞在肺纖維化大鼠模型中的表達(dá)［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，38(7):780-784．

［17］鮑文華，李樹民，穆曉春，等．Th17細(xì)胞、RORγt在肺纖維化大鼠模型中的表達(dá)及意義［J］．臨床肺科雜志，2013，18(6):1075-1078．

［18］Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al．The orphan nuclear receptor ROR gamma-t directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells［J］．Cell，2006，126(6):1121-1133．

［19］Raghu G，Collard HR，Egan JJ，et al．ATS/ERS/JRS/ALAT Committee on Idiopathic Pulmonary Fibrosis．An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidencebased guidelines for diagnosis and management［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，183(6):788-824．

［20］Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW．Two types of murine helper T cell clone．I．Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins［J］．J Immunol．，1986，136(7):2348-2357．

［21］Tan HL，Regamey N，Brown SP，et al．The Th17 pathway in cystic fibrosis lung disease［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，184(2):252-258．