丹梔逍遙散合左金丸對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及細(xì)胞因子的影響

黃　瓊

湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院(湖北 恩施 445000)

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丹梔逍遙散合左金丸對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及細(xì)胞因子的影響

黃瓊

湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院(湖北 恩施 445000)

【摘要】目的研究丹梔逍遙散合左金丸對阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響，探討防治AD的機制。方法選用4月齡KM小鼠80只，隨機分成4組：正常組、模型組、丹左組和腦復(fù)康組，每組20只。采用D氨基半乳糖胺(D-Gal)頸背部皮下注射復(fù)制AD小鼠模型。腦復(fù)康組、丹左組小鼠經(jīng)相應(yīng)藥物按0.04mL/g體質(zhì)量灌胃，每日1次，連續(xù)5周后，進行水迷宮試驗測試行為學(xué)指標(biāo),放射免疫分析法檢測小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果丹左組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強，海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，改善效果強于腦復(fù)康組(P<0.01)。結(jié)論丹梔逍遙散合左金丸能降低AD模型小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，具有治療AD的作用。

【關(guān)鍵詞】丹梔逍遙散合左金丸；老年性癡呆；學(xué)習(xí)記憶；炎性細(xì)胞因子

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，又稱老年性癡呆，是以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的漸行性腦退性疾病或綜合征[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全明了。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積，激活小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)引起的炎癥反應(yīng)是AD的發(fā)病核心。Aβ激活的MG可引起白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子及神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，造成持續(xù)性的神經(jīng)損傷，炎性細(xì)胞因子又可以激活MG，導(dǎo)致神經(jīng)毒性循環(huán)，最終造成鄰近神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，加重神經(jīng)元損傷；細(xì)胞因子誘導(dǎo)Aβ的生成，Aβ沉積、聚集進而形成老年斑，進一步刺激MG合成和分泌細(xì)胞因子，在體內(nèi)形成一個正反饋環(huán)路，因此認(rèn)為炎癥反應(yīng)是AD顯著的病理特點之一[2-3]。選擇合適的藥物控制炎性細(xì)胞因子的分泌已成為研究治療AD的熱點。結(jié)合中醫(yī)對AD病因病機的認(rèn)識，筆者嘗試運用丹梔逍遙散合左金丸治療AD小鼠，觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善情況，及檢測海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗藥物丹梔逍遙散合左金丸，方中藥物柴胡8g，白芍10g，當(dāng)歸10g，丹皮10g，梔子8g，白術(shù)10g，茯苓10g，甘草6g，黃連9g，吳茱萸3g，水煎濾液濃縮為2g/mL，置冰箱冷藏備用。腦復(fù)康：湖北華中藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號：20081027，0.4g/片，將藥片在研缽中研成細(xì)粉，加入蒸餾水，攪拌制成混懸液，濃度0.1g/mL，備用。D氨基半乳糖胺(D-gal)，國藥集團化學(xué)制劑有限公司，批號：F20080109。

1.2實驗試劑碘(125I)白細(xì)胞介素1β放射免疫分析藥盒,碘(125I)白細(xì)胞介素-6放射免疫分析藥盒,碘(125I)腫瘤壞死因子-α放射免疫分析藥盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。

1.3主要儀器γ放射免疫計數(shù)器，SN-695B型。Morris水迷宮及水迷宮自動實驗記錄儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院出產(chǎn)。

1.4實驗動物4月齡KM雄性小鼠80只，體質(zhì)量25～28g，購自湖北省實驗動物研究中心。

1.5實驗方法

1.5.1造模及給藥小鼠籠養(yǎng)，自由攝食與飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、腦復(fù)康治療組(簡稱腦復(fù)康組)、丹梔逍遙散合左金丸組(簡稱丹左組)，每組20只。正常組不予處理，其余組在小鼠頸背部皮下注射120mg/kg D-gal，1次/d，連續(xù)7周，制備AD小鼠模型。7周后，丹左組灌服丹左合方中藥，腦復(fù)康組灌服腦復(fù)康混懸液，分別按0.04mL/g體質(zhì)量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5周。其余組每日灌等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)5周 。

1.5.2Morris水迷宮行為學(xué)實驗①定位航行實驗。平臺位于第四象限中點，第1d將小鼠放至平臺上停留約15s后，將其面向池壁從第一象限入水點放入水中，記錄小鼠在120s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果小鼠在120s內(nèi)未找到平臺，則由實驗者將其牽至平臺，讓其在平臺上停留10s后再放入水中，其逃避潛伏期記為120s。之后直接將小鼠放入水中進行實驗，按順時針方向更換入水點，歷時4d，每天上午、下午各2次。②空間探索實驗。第5d，將平臺移走，任選1個入水點將小鼠放入，記錄小鼠第1次經(jīng)過原平臺的時間(潛伏期)及平臺象限的游泳距離占總距離的百分比(象限百分比)。用于測量小鼠對平臺空間位置記憶的能力。

1.5.3小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的測定

行為學(xué)測試完后第2d處死小鼠，斷頭取腦，迅速分離，取出海馬組織，吸去血跡，稱重，加入生理鹽水1mL碾磨，充分勻漿，將勻漿液以4℃3000rpm離心5min，取上清液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?yán)格按照放射免疫試劑盒說明步驟操作，測定計算海馬每毫克組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

在灌胃給藥過程中，各組均有5只小鼠死亡，最終進行行為學(xué)實驗的小鼠每組15只。

2.1Morris水迷宮行為學(xué)實驗結(jié)果模型組學(xué)習(xí)記憶能力較正常組、丹左組、腦復(fù)康組明顯下降。與模型組、腦復(fù)康組比較，丹左組能明顯縮短小鼠逃避潛伏期和潛伏期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1、表2。

表1　各組小鼠定位航行能力的比較 (n=15,±s)

組別4d逃避潛伏期/s后2d逃避潛伏期/s正常組28.51±2.2616.52±1.09模型組61.09±1.51▲53.13±1.46▲丹左組40.02±1.21▲△★29.01±1.31▲△★腦復(fù)康組50.96±1.39▲△32.01±1.57▲△

注：與正常組比較，▲P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與腦復(fù)康組比較，★P<0.01。

表2　各組小鼠空間探索能力的比較(n=15,±s)

表2　各組小鼠空間探索能力的比較(n=15,±s)

組別潛伏期/s象限百分比/%正常組20.05±1.2049.08±0.16模型組52.09±1.98▲30.15±1.71▲丹左組26.79±1.81▲△★41.21±1.08▲△★腦復(fù)康組36.98±1.81▲△34.98±1.59▲△

注：與正常組比較，▲P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與腦復(fù)康組比較，★P<0.01。

2.2各組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量正常組海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)藥物干預(yù)后，細(xì)胞因子明顯下降(P<0.01)，丹左組下降更顯著(P<0.01)，見表3。

表3　各組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(n=15，±s，ng·mg-1)

表3　各組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(n=15，±s，ng·mg-1)

組別IL-1βIL-6TNF-α正常組0.19±0.221.85±0.055.02±0.11模型組0.40±0.02▲6.02±0.03▲9.81±0.30▲丹左組0.23±0.02△★2.59±0.09△★6.77±0.29△★腦復(fù)康組0.30±0.09△2.89±0.07△7.39±0.17△

注：與正常組比較，▲P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與腦復(fù)康組比較，★P<0.01。

3　討論

中醫(yī)認(rèn)為AD病位在腦，而腦的功能與五臟有關(guān)，腦功能失常產(chǎn)生的病變也歸屬于五臟。肝主疏泄可調(diào)節(jié)情志活動，“肝藏魂”，“肝主謀慮”，“肝在志為怒”，說明肝與神志活動密切相關(guān)?！毒霸廊珪?·雜證謨》云：“癡呆證凡平素?zé)o痰，而或以郁結(jié)、或以不遂、或以思慮、或以驚恐而致癡呆”?！侗孀C錄 ·呆病門》云：“大約其始也，起于肝氣之郁”。 《辨證錄》有云：“人有氣機不疏，忽忽如有所失，目前之事竟不記憶，夫肝氣最急，欲則不能急矣，于是腎氣來滋，致肝則止，心氣來降，至肝則回，以致心腎兩間隔，致有遺忘也……” 《靈樞經(jīng) ·本神》云：“肝，悲哀動中則傷魂，魂傷則狂妄不精”，都明確指出肝與癡呆的關(guān)系。若肝疏泄功能正常、氣機調(diào)暢、五臟氣血調(diào)和，魂有所舍，則人的神志活動正常。人體氣血均上達(dá)頭面部，發(fā)揮其濡養(yǎng)腦髓的功能。若肝氣郁滯，則氣不行水致痰濁內(nèi)生，氣不行血致瘀血內(nèi)停。氣郁痰濁瘀血壅于五臟，氣血不能正常上達(dá)腦部；肝氣郁滯影響脾胃的運化功能致氣血生成不足，氣血不足、氣血瘀阻都可導(dǎo)致腦失所養(yǎng)，神明失用而發(fā)為AD。張艷霞等[4]通過檢索現(xiàn)代AD文獻，發(fā)現(xiàn)AD病因證素中以痰、血瘀、氣滯為主。肝氣郁滯日久可導(dǎo)致肝火熾盛，痰濁瘀血壅于五臟日久，也能郁而化火，火熱之邪上擾清竅，神機失用發(fā)為AD。因此筆者認(rèn)為肝郁氣滯，肝火熾盛是導(dǎo)致AD的一個重要病機。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為炎性反應(yīng)與AD關(guān)系密切，許多藥物可通過抑制其炎性反應(yīng)達(dá)到治療AD的目的，質(zhì)子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑可以抑制TNF-α和 IL- 6的分泌，非甾體類抗炎藥聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑可能對AD的治療有協(xié)同作用，過氧化酶活化增生受體抗體可以抑制IL-10的分泌，依那西普是一種人免疫球蛋白，它可以結(jié)合TNF-α，抑制其促炎效應(yīng)[5]。因此進一步尋找天然抗炎藥物及探討其作用機制的研究就顯得非常必要。

丹梔逍遙散合左金丸，丹梔逍遙散養(yǎng)血健脾，疏肝清熱，方中柴胡苦辛、微寒，善條達(dá)肝氣，疏肝解郁；白芍酸苦微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急，有研究表明芍藥中的芍藥苷可以改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6]；當(dāng)歸辛行溫通，養(yǎng)血和血，且可理氣，為活血行氣之要藥，研究表明當(dāng)歸中的阿魏酸等有效成分對AD具有保護損傷后腦細(xì)胞，抗炎，減緩記憶消退，抗衰老及氧化等作用[7]；柴胡、白芍、當(dāng)歸合用補肝體調(diào)肝用，使血和肝和，血充肝柔；肝郁血虛日久，則生熱化火，牡丹皮微寒，能清熱、活血；梔子苦寒，瀉火除煩，牡丹皮梔子合用增加了清熱、活血、通經(jīng)的功效；白術(shù)、茯苓、甘草健脾益氣，一可實土以御木乘，二可使脾胃功能健旺，氣血生化有源。左金丸清肝瀉火和胃，方中黃連苦寒，清瀉肝火；肝之氣郁化火證，純用苦寒之品，恐郁遏傷中，故佐以辛熱之吳茱萸，一則辛散解郁，主入肝經(jīng)，可疏泄肝經(jīng)郁氣，使肝氣條達(dá)；二則制黃連之寒，使火瀉而無涼遏之弊；三則可引黃連入肝經(jīng)。王林艷等[8]認(rèn)為黃連與吳茱萸配伍，可抑制白介素等物質(zhì)的分泌，還有較強的抗抑郁作用。二方合用，共奏疏肝解郁，清熱瀉火，健脾養(yǎng)血之功效。

本結(jié)果顯示前2d，各組小鼠基本上都是圍繞池壁游泳，很少接近平臺。從第3d開始丹左組小鼠運動軌跡多在平臺象限，找到平臺位置的時間逐漸縮短，與模型組、腦復(fù)康組比較均有顯著差異。4d潛伏期丹左組與模型組、腦復(fù)康組比較有顯著性差異(P<0.01)；后2d潛伏期丹左組與模型組、腦復(fù)康組比較有顯著性差異(P<0.01)，表明丹左組有較強的學(xué)習(xí)能力。空間探索試驗表明丹左組小鼠找到平臺的時間較模型組與腦復(fù)康組短，丹左組小鼠主要在原平臺象限尋找平臺，丹左組與模型組、腦復(fù)康組比較有顯著性差異(P<0.01)，表明丹左組有較強的空間記憶能力。對IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響，丹左組能顯著降低IL-1β、IL-6、TNF-α含量，與模型組、腦復(fù)康組比較有顯著性差異(P<0.01)。

以上的實驗結(jié)果表明，丹梔逍遙散合左金丸能通過降低小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，減輕AD模型小鼠炎癥反應(yīng)，達(dá)到增強AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的作用，可用于AD的治療。

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The Effects of Danzhi Xiaoyao Powder Combined with Zuojin Pills on the Ability of Learning and Memory, Inflammatory Cytokines of AD Model Mice

HUANG Qiong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,HubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of Danzhi Xiaoyao Powder Combined with Zuojin Pills on improving the AD model of learning and memory ability of mice, and in hippocampus of mice brain IL-1,IL-6,TNF-α content.Methods The 80 mice of four months old were randomly divided into normal group, model group, piracetam group, Dan Zuo group, with 20 rats in each group. Using D-gal to subcutaneous injection to make the mold preparation AD mouse model. The operation group mice by different drugs were given by gavage for 5 weeks, the mice were put to water maze test, and Radioimmunoassay was adopted to determine the content of IL-1β,IL-6, TNF-α in hippocampus of mice.Results Dan Zuo group can significantly improve the AD model of learning and memory ability of mice,the differences were significantly compared with the piracetam group (P<0.01). IL-1,IL-6,TNF-α:Dan Zuo group decreased IL-1,IL-6,TNF- α,there was significant difference when compared with the piracetam group (P<0.01).Conclusion Danzhi Xiaoyao Powder combined with Zuojin Pills can enhance the ability of learning and memory on AD mice and save memory, can reduce the content of AD in the hippocampus of mice model of IL-1β,IL-6,TNF-α,and has a role in the treatment of AD.

【Key words】Danzhi Xiaoyao Powder combined with Zuojin Pills; Alzheimer disease; learning and memory; inflammatory cytokines

[收稿日期2014-04-02]

【中圖分類號】R285.5

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1008-8164(2014)03-0015-04

作者簡介黃瓊(1975- )，女，湖北恩施人，副教授，博士，主要研究方向：老年病病因病機的探討及研究。