Parkin基因突變和線粒體功能紊亂與帕金森病的相關(guān)性

Parkin基因突變和線粒體功能紊亂與帕金森病的相關(guān)性

姜立志1沈麗華孫翠

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南通226001)

關(guān)鍵詞〔〕帕金森??；Parkin基因；線粒體功能

中圖分類號〔〕R742.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：沈麗華(1969-)，女，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師,主要從事神經(jīng)元變形性疾病的臨床研究。

據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計，我國65歲以上人群中帕金森病(PD)發(fā)病率與西方發(fā)達(dá)國家相似，約為1.7%，且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加〔1〕。但目前對于PD的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，老年化因素、環(huán)境因素、遺傳因素均與PD的發(fā)病相關(guān)。流行病學(xué)研究顯示，10%～15%的PD患者有家族史〔2〕。家族性PD相關(guān)基因見文獻(xiàn)〔3〕，家族性PD與基因突變有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)為疾病的細(xì)胞和分子路徑提供了一個新的入口〔4〕。迄今為止，已確定的PD相關(guān)易感基因有α-synuclein、Parkin、UCH-L1、DJ-1、PINK1、LRRK2、ATP13A2 及HTRA2，其中Parkin、DJ-1、PINK1 與常染色體隱性遺傳性PD相關(guān)〔5〕。

1Parkin與PD

Parkin最早是Matsumine等〔6〕在研究日本13個常染色體隱性遺傳性青少年型PD家系時發(fā)現(xiàn)，由Kitada首先克隆并命名〔7〕。Parkin基因的突變在家族性隱性早發(fā)性PD中占50%，在早發(fā)型散發(fā)病例中也占據(jù)了15%～20%，發(fā)病年齡≤50歲〔8〕。此類患者的特異性臨床特點(diǎn)包括：早期出現(xiàn)運(yùn)動癥狀伴有緩慢的臨床過程、對低劑量的多巴胺敏感、長期治療可以出現(xiàn)運(yùn)動障礙的并發(fā)癥，且常伴有焦慮、精神錯亂、強(qiáng)迫癥、抑郁〔9〕。Parkin蛋白由3個功能域構(gòu)成：①氨基端的泛素樣區(qū)(Ub1)，其功能是與底物結(jié)合；②羥基端的環(huán)指結(jié)構(gòu)，其功能主要是連接泛素結(jié)合酶，作為新的鋅指蛋白，控制細(xì)胞生長、分化與發(fā)育，可能與真核細(xì)胞分化、成長和死亡控制有關(guān)；③前兩者的鏈接區(qū)，前兩者為功能區(qū)，在遺傳上高度保守。臨床資料顯示大片段缺失突變或點(diǎn)突變的突變熱點(diǎn)區(qū)分別在這兩個保守區(qū)〔10〕。見圖1。

圖1　Parkin分子結(jié)構(gòu)及PD相關(guān)突變的示意圖 〔11〕

1十堰市鄖西縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

第一作者：姜立志(1983-)，男，在讀碩士,主要從事神經(jīng)元變形性疾病的臨床研究。

Parkin的分布廣泛，在腦和外周組織中均有表達(dá)。早期的研究報道發(fā)現(xiàn)，Parkin在腦的黑質(zhì)和藍(lán)斑處的神經(jīng)元有豐富的表達(dá)〔12〕。目前研究已證實parkin也可存在于外周組織細(xì)胞的胞質(zhì)、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中〔13〕。Parkin蛋白具有多重功能，在底物蛋白降解、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等方面都起著十分廣泛的作用，并且在PD的氧化應(yīng)激、線粒體損傷及蛋白酶體功能紊亂中起著重要作用。

1.1Parkin與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)UPS是細(xì)胞內(nèi)一種重要的蛋白降解途徑。Parkin最初是作為E3泛素連接酶被報道，它通過蛋白酶體介導(dǎo)清除細(xì)胞中的各種物質(zhì)〔14〕。細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性降解依賴于泛素分子轉(zhuǎn)運(yùn)者通過酶的級聯(lián)反應(yīng)識別目標(biāo)蛋白，最終通過UPS降解。因此，UPS功能障礙或者超負(fù)荷會導(dǎo)致蛋白質(zhì)底物的蓄積，在多巴胺神經(jīng)元中蓄積的蛋白質(zhì)底物導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性，在腦組織中形成包涵體，稱路易小體。Parkin蛋白的底物蛋白已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種，如：DJ-1〔15〕、Hsp70〔16〕、PICK1〔17〕、α-酮戊二酸載體蛋白〔18〕等。見圖2。

圖2　UPS降解底物的示意圖 〔19〕

1.2Parkin與線粒體功能線粒體均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中，是物質(zhì)氧化能量供應(yīng)的場所，為機(jī)體的生命活動提供所需要的能量，同時介導(dǎo)細(xì)胞程序化凋亡。PD患者的中腦黑質(zhì)細(xì)胞中，存在一段4 977bp長的DNA缺失，結(jié)果導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體功能缺陷，進(jìn)而引起神經(jīng)元能量代謝障礙。因此，線粒體損傷或線粒體功能紊亂是PD發(fā)病的主要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)Parkin與線粒體的功能和形態(tài)有著密切的聯(lián)系。Parkin與線粒體之間的聯(lián)系最初被觀察是在神經(jīng)酰胺治療細(xì)胞中阻止細(xì)胞色素C的釋放〔20〕。后來在Parkin基因敲除的動物模型研究中證實Parkin基因在維持線粒體功能中扮演著重要的角色：Parkin敲除鼠出現(xiàn)了線粒體功能紊亂和氧化損傷，Parkin基因剔除果蠅中發(fā)現(xiàn)線粒體病變和DA神經(jīng)元丟失〔20，21〕。同時細(xì)胞離體實驗也證明了Parkin選擇性泛素化凋亡蛋白(Bax)，通過阻止線粒體免受Bax的損傷，從而達(dá)到抗凋亡作用〔22〕。在線粒體毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中，Parkin的高表達(dá)可以對細(xì)胞起到保護(hù)作用；而Parkin突變時Bax的表達(dá)明顯增高，細(xì)胞凋亡增加〔22〕。Parkin在線粒體的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。它通過與線粒體DNA直接結(jié)合，保護(hù)線粒體DNA免受活性氧(ROS)的損傷并激發(fā)線粒體的自我修復(fù)過程〔23〕。在增殖的細(xì)胞中，Parkin的過表達(dá)可以增加線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和修復(fù)水平，而且Parkin可以通過結(jié)合線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)來增加介導(dǎo)的線粒體蛋白轉(zhuǎn)錄，從而維持線粒體穩(wěn)態(tài)〔24，25〕。同時線粒體的應(yīng)激能通過轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)4上調(diào)誘導(dǎo)特殊ParkinmRNA和蛋白的水平增加〔26〕。

1.3Parkin與線粒體自噬許多研究已證實Parkin在PINK1的參與下通過選擇性自噬功能障礙的線粒體，從而參與線粒體的質(zhì)量控制〔27〕，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。自噬是一個動態(tài)的過程，它可分為4個階段：①細(xì)胞在饑餓、氧化損傷等情況下，一個杯狀膜結(jié)構(gòu)吞噬胞質(zhì)中的被降解物；②隨后這個膜結(jié)構(gòu)逐漸延伸，形成一個囊狀結(jié)構(gòu)，也叫自噬體；③自噬體形成后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體；④形成的自噬溶酶體允許水解酶降解內(nèi)部的生物化學(xué)部件〔28〕。在正常狀態(tài)下，Parkin絕大部分定位于胞質(zhì)中，但有實驗證明在線粒體氧化劑羰基氰酯-3-氯苯基腙(CCCP)處理下的細(xì)胞中Parkin從胞質(zhì)遷移到了線粒體，它通過激活自噬系統(tǒng)、調(diào)節(jié)自噬水平以降解受損的線粒體〔13〕。

2線粒體功能紊亂與PD

線粒體在大多數(shù)真核生物的代謝過程中提供能量，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平，調(diào)控細(xì)胞凋亡；清除去極化的自噬體或損傷的線粒體。線粒體有內(nèi)外兩層膜，折疊形成脊；傳統(tǒng)上被認(rèn)為是獨(dú)立的細(xì)胞器，線粒體形成復(fù)雜的分枝網(wǎng)是由于它具有移動、融合的活動能力。豐富的線粒體形式在不同的組織中取決于他們對氧化磷酸化的依賴。神經(jīng)元及心肌、骨骼肌含有較高密度的線粒體，也說明他們特別容易受到線粒體損傷引起的能量缺乏的侵害〔29〕。線粒體穩(wěn)態(tài)的改變在PD患者的組織中已被證實，如細(xì)胞培養(yǎng)和基因檢測〔30〕。

2.1線粒體功能紊亂與氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激可被解釋為氧化劑和抗氧化劑平衡紊亂時的條件反射，前者是一種潛在的細(xì)胞損傷〔31〕。在PD的發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激起重要作用。線粒體在氧化呼吸的過程中消耗氧氣同時傳遞電子，電子通過氧化呼吸傳遞給氧生成水。然而線粒體功能紊亂，會使氧不能得到有效利用，導(dǎo)致大量電子外露，直接對氧進(jìn)行單電子還原，生成氧氣離子。氧離子又被位于線粒體基質(zhì)的超氧化物歧化酶(SOD)歧化生成氧氣(O2)和過氧化氫水(H2O2)，因此就形成了氧自由基(O-)。氧自由基可以引起生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和膜磷脂等損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)胞功能和能量代謝〔32〕。在細(xì)胞中過多的O-可能導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂質(zhì)雙分子層的氧化損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元功能破壞和細(xì)胞壞死；H2O2可以穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮它的生物學(xué)效應(yīng)；除此之外金屬的氧化還原反應(yīng)也可成為細(xì)胞潛在的毒性〔33〕。

氧化應(yīng)激使神經(jīng)元平衡紊亂引起脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)改變，DNA突變，同時也引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的形成，因此能量供應(yīng)減低，線粒體動力學(xué)異常，干擾線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少神經(jīng)元適應(yīng)性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡〔34〕。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔形成的主要后果包括鈣快速流出線粒體，減少質(zhì)子梯度，損傷線粒體呼吸，增加ROS生成，釋放凋亡因子到細(xì)胞質(zhì)，線粒體腫脹，線粒體膜破裂〔34〕。

人體細(xì)胞中也存在著氧化應(yīng)激的防御系統(tǒng)，如谷胱甘肽(GSH)、抗氧化劑酶及維生素E(VE)等〔35〕。細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH能拮抗不同的O-，另外，活細(xì)胞內(nèi)各種大量的酶也直接或間接參與O-的清除，如GSH還原酶不僅負(fù)責(zé)GSH的循環(huán)，對氧化物的內(nèi)源性解毒也起到重要作用〔36〕。疾病早期SOD、GSH過氧化物酶(GSH-Px)升高可能為氧化應(yīng)激所致。

在生物體內(nèi)，腦組織更易受氧化反應(yīng)及其產(chǎn)生的自由基的損害，這是因為：①它含有大量的、高濃度的不飽和脂肪酸；②大腦需要相對更多的O2供應(yīng)；③腦內(nèi)自由基清除功能相對缺乏，與肝臟相比，它的GSH、GSH-Px及VE含量較低；④腦組織內(nèi)鐵的含量相對較高。以上幾點(diǎn)在黑質(zhì)中表現(xiàn)得最為突出〔37〕。因此，氧化應(yīng)激水平的增高更容易損傷多巴胺能神經(jīng)元。此外，氧化反應(yīng)的產(chǎn)物影響膜配體與受體的結(jié)合〔31〕，如影響多巴胺與多巴胺受體的結(jié)合，抑制乙酰膽堿的能力下降。

2.2線粒體功能紊亂與細(xì)胞代謝哺乳動物所吸入的O290%進(jìn)入細(xì)胞，在線粒體通過氧化磷酸化為生物體提供80%的ATP，然而20%的氧進(jìn)入細(xì)胞后生成活性氧，他們帶有孤電子被稱為自由基〔31〕。細(xì)胞的氧化呼吸在線粒體中進(jìn)行，在酶的催化作用下氨基酸、脂肪、糖等供能物質(zhì)氧化而釋放能量，通過電子傳遞和氧化磷酸化將這些能量以高能磷酸鍵的形式儲存在ATP中，為細(xì)胞的各種生命活動提供能量。如在神經(jīng)元的電子傳遞中所消耗的能量來源于線粒體〔38〕，也可以說神經(jīng)元的興奮性高度依賴線粒體產(chǎn)生的ATP。

2.3線粒體與細(xì)胞凋亡有證據(jù)證明，PD患者中存在線粒體復(fù)合物Ⅰ及氧化還原能力降低，ROS生成增加及氧化應(yīng)激的發(fā)生。上述現(xiàn)象導(dǎo)致線粒體膜電位去極化進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放，大量小分子蛋白物質(zhì)包括細(xì)胞色素C、Bax和凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道釋放出來，激活半胱冬肽酶依賴性和非依賴性細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔7〕。同時由于ATP的供應(yīng)不足，Ga2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ga2+濃度增加導(dǎo)致線粒體Na2+、Ga2+質(zhì)子泵功能下降以及細(xì)胞通透性改變，當(dāng)膜的表面孔道開放時，可釋放細(xì)胞色素C，誘導(dǎo)凋亡因子分泌最終觸發(fā)凋亡過程。

3Parkin基因突變與線粒體功能紊亂

Parkin基因的突變具有明顯的多樣性，該基因有12個外顯子，均可有不同程度的序列改變，其中以4、6、7號外顯子最為常見，他們都處于突變的熱點(diǎn)區(qū)域〔39〕。Parkin基因不僅作為泛素連接酶通過UPS參與蛋白質(zhì)底物的降解，也參與線粒體的功能調(diào)節(jié)和形態(tài)維持〔7〕，同時和線粒體的自噬也有關(guān)系。這就帶來一個問題，Parkin基因不同位點(diǎn)的突變可能造成不同系統(tǒng)的功能改變，在PD的發(fā)病機(jī)制中也扮演著不同的角色。

近幾年，有關(guān)報道認(rèn)為Parkin2、3外顯子的缺失性突變可能是導(dǎo)致線粒體功能紊亂的重要因素。Palacino等〔40〕發(fā)現(xiàn)在Parkin3號外顯子剔除的小鼠中出現(xiàn)了線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的減少、線粒體氧化呼吸作用減少和隨著年齡增長的氧化損傷增加的現(xiàn)象。Pacelli等〔20〕在2例早發(fā)性PD患者的皮膚初級纖維母細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)以前未報道過的復(fù)合雜合突變：Parkin基因的2～3號外顯子或3號外顯子缺失，導(dǎo)致完整的整段蛋白丟失。并觀察到幾個超微結(jié)構(gòu)的畸形，最主要的是線粒體，認(rèn)為Parkin基因2、3號外顯子可能參與線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)，這一完整蛋白的丟失與能量代謝損傷有關(guān)，解除了對ROS產(chǎn)生的抑制，結(jié)果是脂質(zhì)氧化和過氧化物酶改變。同時他們還認(rèn)為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物是PD發(fā)病機(jī)制中早期標(biāo)志，甚至在臨床表現(xiàn)之前出現(xiàn)，直到異常增高到一定水平才會出現(xiàn)臨床癥狀。Gaweda-Walerych等〔25〕在波蘭PD患者中研究Parkin的多態(tài)性與線粒體單倍的相互作用時發(fā)現(xiàn)：Parkin基因2號外顯子的缺失與TFAM和單倍體mtDNA相互關(guān)系。

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〔2013-06-19修回〕

(編輯安冉冉/杜娟)