耦聯(lián)CD133/ABCG2抗體的熒光磁性納米微粒的制備與靶向性實驗

耦聯(lián)CD133/ABCG2抗體的熒光磁性納米微粒的制備與靶向性實驗

黃躍英雷康熊虎殷香保黃長文

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的制備耦聯(lián)抗CD133及ABCG2抗體的熒光Fe3O4納米微粒，用于肝癌的早期診斷和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移后的定位。方法采用共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子，在其外面包裹羧基化葡聚糖，然后與帶有熒光基團的CD133及ABCG2抗體耦聯(lián)，制備成一種可以檢測CD133和 ABCG2雙陽性細(xì)胞的免疫磁性納米微粒，繼而檢測其表征和抗性；體外檢測制備的磁性納米微粒對人SP細(xì)胞的靶向性；肝癌 SP 細(xì)胞裸鼠皮下種植制作肝癌模型，尾靜脈注射經(jīng)篩選的納米微粒，用熒光顯微鏡觀察磁性納米微粒的體內(nèi)靶向作用。結(jié)果成功制備得到了具有磁性、粒度均勻的磁性納米微粒，且在體內(nèi)外均有熒光和對腫瘤干細(xì)胞的靶向性。結(jié)論成功制備得到了可用于檢測CD133及ABCG2雙陽性肝癌干細(xì)胞的免疫熒光磁性納米微粒。

關(guān)鍵詞〔〕肝癌干細(xì)胞；磁性納米；抗體；CD133；ABCG2

中圖分類號〔〕R735.7〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.GJJ 11309);江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(No.20131078);江西省科技計劃項目(No.20132BBG70048);江西省自然科學(xué)基金資助項目(No.20114BAB205017)

通訊作者：黃長文(1967-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事肝膽腫瘤與臨床研究。

第一作者：黃躍英(1968-)，女，副主任護師，主要從事肝癌的基礎(chǔ)研究。

肝癌是嚴(yán)重威脅人類身體健康的惡性腫瘤之一，在早期能夠診斷出肝癌可以大幅度提高患者的存活率。腫瘤干細(xì)胞是癌癥發(fā)生、 轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源。如果能夠檢測到腫瘤干細(xì)胞的存在就提示惡性腫瘤的發(fā)生。通過檢測細(xì)胞表面分子判斷細(xì)胞類型是目前比較方便準(zhǔn)確快捷的方法，通過檢測細(xì)胞表面分子確定腫瘤干細(xì)胞的存在，可以成為癌癥的診斷和治療效果等臨床階段一種快速方便準(zhǔn)確的檢測方法。CD133是一種分子量為120 kD的跨膜蛋白，CD133+細(xì)胞亞群(SP細(xì)胞)具有較強的克隆形成和無限增殖的特性，是被廣泛認(rèn)可的腫瘤干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記分子之一〔1〕。ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一個成員，ABCG2主要存在于干細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞的頂膜，參與了腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。所以普遍認(rèn)為ABCG2和CD133+是肝癌干細(xì)胞最重要的表面標(biāo)志物〔2〕。磁共振成像(MRI)技術(shù)是目前快速檢測人體組織器官最有效的臨床診斷手段之一，被廣泛應(yīng)用于組織器官病變檢測尤其是腫瘤檢測。磁性納米顆粒可以使磁共振檢測信號增強，所以可以作為磁共振造影劑應(yīng)用于腫瘤的臨床檢測〔3〕。所以我們設(shè)想制備一種耦聯(lián)抗 CD133 及 ABCG2 抗體的熒光 Fe3O4納米微粒，并檢測其在體內(nèi)外的靶向性，為肝癌的超早期診斷奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器FeCl3-6H2O(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，F(xiàn)eCl2-6H2O(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，NH4Fe(SO4)6H2O(株洲市化學(xué)工業(yè)所)，檸檬酸鈉(河南焦作市化工廠)，葡聚糖T-70(Pharmacia公司)，溴乙酸(上海試劑四廠)，Zeta電位分析儀ZEN3600(Malvern公司)，透射電鏡JEM-1230(Rigaku公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，BD公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.2實驗方法

1.2.1羧甲基葡聚糖(CMD)的制備稱取2 g葡聚糖T-70，加入10 ml溴乙酸-NaOH溶液中，在室溫下攪拌24 h。將溶液用三蒸水和0.1 mol/L的鹽酸交替透析24 h ，然后冷凍干燥，可得到白色絮狀CMD，4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2CMD-Fe3O4的制備稱取0.27 g FeCl3-6H2O、0.1 g FeCl2-6H2O和250 mg CMD，分別溶于10 ml三蒸水中并超聲溶解，將三種溶液在氮氣的保護下混合。通氮氣下將溶液置于75℃水浴中攪拌，加氨水調(diào)節(jié)pH至10作用。繼續(xù)攪拌約30 min后，取出后平衡至室溫，然后用磁鐵進(jìn)行磁性分離。將沉淀用三蒸水洗滌至中性，冷凍干燥。

1.2.3CMD-Fe3O4與anti-CD133-GFP/anti-ABCG2作用分別稱取 0.001 5 g anti-CD133-GFP/anti-ABCG2，溶于 1.5 ml 的10 mmol/L pH12 的PBS溶液中。稱取0.01 g CMD-Fe3O4，溶解于2 ml的三蒸水中，超聲溶解后取上層溶液，加入0.03 g EDC和0.01 g NHS，混合均勻，室溫下活化羧基3 h，磁場下分離，分離后洗滌磁性納米粒子二次。加入50 μl的抗體溶液和 950 μl中性10 mmol/L PBS，混勻后于 4℃反應(yīng) 12 h。磁性分離后，用PBS溶液洗滌納米粒子二次，既得免疫磁性納米微粒。

1.2.4透射電鏡取稀釋10 000倍的樣品溶液滴加到干凈的銅網(wǎng)上，室溫下晾干后在(23±2)℃的測試溫度下進(jìn)行檢測。

1.2.5人肝癌SP細(xì)胞的提取分離首先將高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H接種到裸鼠皮下，在腫瘤直徑達(dá)1.5 cm時無菌獲取腫瘤，將腫瘤剪成約1 mm3大小，用Ⅱ型膠原酶(1 mg/ml)37℃孵育60 min將組織消化為細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次。將細(xì)胞在含生長因子的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，CD133+免疫磁珠法分選出CD133+SP細(xì)胞。將1×107細(xì)胞重懸于緩沖液中，充分吹打制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液與稀釋200倍的兔抗CD133多克隆抗體充分混勻后4℃避光孵育1 h，然后離心漂洗。加入稀釋5倍的羊抗兔免疫二抗磁珠，輕輕震蕩以充分混勻，于4℃共孵育15 min，離心后漂洗兩次。棄上清，細(xì)胞中加入適量緩沖液充分吹勻后滴加到已外加磁場中的MS柱中，下接離心管。收集通過MS柱的細(xì)胞，即為未標(biāo)記上的CD133陰性細(xì)胞。去掉外加磁場，向MS柱中加入適量緩沖液，將吸附在MS柱上的CD133陽性細(xì)胞加壓推出，離心后收集細(xì)胞(CD133+SP細(xì)胞)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測人SP細(xì)胞的熒光強度取分離獲得的CD133+SP細(xì)胞1×107，加入10 μg磁性納米微粒，混勻后37℃孵育6 h。處理后的細(xì)胞用PBS清洗后通過FACS Calibur (BD Bioscience)流式細(xì)胞儀檢測，所得數(shù)據(jù)用WinMDI 2.9軟件進(jìn)行細(xì)胞表型分析。

1.2.7磁性納米微粒體內(nèi)靶向性的檢測將分選所得SP細(xì)胞接種到裸鼠皮下，在腫瘤直徑達(dá)1.5 cm時尾靜脈注射磁性納米微粒20 μg/只，6 h后用熒光顯微鏡觀察腫瘤熒光強度。

2結(jié)果

2.1磁性納米微粒的磁性檢測將制備好的磁性納米微粒冷凍干燥后分為相等的兩份分別置于石英皿中，如圖1中左圖所示，在外加磁場的吸引下，微粒向磁鐵方向聚集。

圖1　磁性納米微粒的磁性檢測

2.2磁性納米微粒的TEM圖像圖2可見，磁性納米微粒的粒徑大小50～75 nm，外形呈不規(guī)則球狀，有一定團聚現(xiàn)象，分布較均勻。部分微粒的中心顏色較深，邊緣部位的顏色較淺，這是因為其中心為Fe3O4，外周包裹了CMD。

2.3與磁性納米微粒孵育后SP細(xì)胞的熒光強度如圖3所示，左圖為未同磁性納米微粒孵育的SP細(xì)胞的結(jié)果(陰性對照組)，右圖為共孵育后SP細(xì)胞的GFP的表達(dá)水平，可見制備所得的磁性納米微粒對SP細(xì)胞在體外有較好的細(xì)胞靶向作用。

圖2　磁性納米微粒的TEM圖

圖3　磁性納米微粒對SP細(xì)胞的靶向性

2.4磁性納米微粒的體內(nèi)靶向作用如圖4所示，注射磁性納米微粒后，腫瘤部位顯示可檢測到的熒光，而對照組未檢測到熒光，說明磁性納米微粒在體內(nèi)也有良好的靶向性。

圖4　荷瘤裸鼠尾靜脈注射磁性納米微粒后腫瘤的熒光強度

3討論

癌癥的診斷方法一直不盡人意，一般確診的癌癥都是晚期，癌癥的早期診斷一直是業(yè)界的一個難題。腫瘤組織中存在含量極少、具有無限增殖潛能的腫瘤干細(xì)胞，這些高致瘤性腫瘤干細(xì)胞是引起腫瘤難以治愈的根源。肝癌干細(xì)胞的來源及其表面標(biāo)志物還存在爭議。ABCG2、CD133、CD34、CK7、c-ki等可能是人肝癌干細(xì)胞的部分表型標(biāo)志。國內(nèi)外學(xué)者通過側(cè)群細(xì)胞技術(shù)及CD133鑒定和分離得到具有很強的體外克隆形成及體內(nèi)成瘤能力的SP細(xì)胞〔3〕，而且與CD133-肝癌SP細(xì)胞相比，CD133+肝癌SP細(xì)胞具有更強的克隆形成和增殖能力〔3，4〕；通過從人肝癌組織中分離肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，裸鼠皮下接種2 000個SP細(xì)胞的成瘤率為100%〔5〕。另一組國內(nèi)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CD133-患者的平均生存率較CD133+患者顯著延長，提示CD133不僅與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，還有望成為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一〔6〕。

多藥抗性的產(chǎn)生常常伴隨著ABC家族中一個或幾個成員的過表達(dá)，特別是ABCG2蛋白的過表達(dá)。該轉(zhuǎn)運蛋白是P-糖蛋白，由多藥抗性蛋白(MDR)1的基因和多藥抗性相關(guān)蛋白(MAP)的基因編碼。作為一個具有廣泛底物作用的特異性外排泵，ABCG2主要存在于干細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞的頂膜。研究表明，ABCG2是腫瘤干細(xì)胞主要的ABC轉(zhuǎn)運蛋白，SP細(xì)胞通過ABCG2將熒光活性染料Hoechst33342排出細(xì)胞

外，正是據(jù)于此，SP細(xì)胞被鑒定、分離。 ABCG2在SP中呈高表達(dá)還使進(jìn)入細(xì)胞中的藥物被排出胞外，故該功能被認(rèn)為參與了腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。目前，很多學(xué)者研究證實、認(rèn)可了ABCG2和CD133+細(xì)胞在原發(fā)性肝癌中的干細(xì)胞作用，并認(rèn)為ABCG2和CD133+是肝癌干細(xì)胞最重要的表面標(biāo)志物。

磁性納米粒子是將Fe3O4制備成納米級微粒，由于其具有磁性這一特性，且可以與多種無機或有機分子結(jié)合，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸獲得廣泛應(yīng)用。將磁性微球包被有免疫活性的物質(zhì)稱為免疫磁珠(IMMs)，是一種進(jìn)行免疫學(xué)或者生物學(xué)分析分離等應(yīng)用的一種技術(shù)〔7,8〕。近年來，利用免疫磁珠對各種細(xì)胞進(jìn)行定位、分離和檢測的方法引起了廣泛關(guān)注和研究。如Grossman等〔9〕將免疫磁珠和超導(dǎo)電子干涉裝置聯(lián)合運用，用于特定細(xì)菌的檢測。

本實驗結(jié)果表明，我們制備得到的磁性納米微粒具有均勻的粒徑、良好的磁性和體內(nèi)外靶向性，該結(jié)果有望在肝癌干細(xì)胞出現(xiàn)(瘤體尚未形成或極微小)時就有可能檢測并定位肝癌，為肝癌的超早期診斷和靶向肝癌干細(xì)胞治療奠定了基礎(chǔ)。

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〔2013-12-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)