粒細胞集落刺激因子對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

粒細胞集落刺激因子對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

肖興花

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東臨沂276400)

摘要〔〕目的探討粒細胞集落刺激因子對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響。方法將成年雄性SD大鼠隨機分為假手術組、腦出血組、處理組，采用稱重法測定腦組織的含水量，采用Western印跡法檢測腦組織中Bax及Bcl-2的蛋白表達情況。結果結果：①腦水腫程度：手術后6、12、24、48 h時，腦出血組大鼠的腦組織含水量高于假手術組，治療組大鼠的腦組織含水量低于腦出血組；②Bax及Bcl-2蛋白表達：腦出血組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量低于假手術組，Bax的蛋白含量高于假手術組；治療組大鼠大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量高于腦出血組，Bax的蛋白含量低于腦出血組。結論粒細胞集落刺激因子治療能夠改善實驗性腦出血大鼠的腦組織水腫程度、調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2表達、抑制細胞凋亡，可能成為治療腦出血的理想方法。

關鍵詞〔〕腦出血；粒細胞集落刺激因子；凋亡分子；Bax；Bcl-2

中圖分類號〔〕R743〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：肖興花(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

腦出血是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)急癥，臨床上多采用血腫清除術進行治療，但是患者多會殘留神經(jīng)功能損害并對日常生活造成影響。改善腦出血后神經(jīng)功能的恢復情況是臨床研究的熱點。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有動員骨髓干細胞的功能，進而對神經(jīng)功能進行修復〔1〕。Bax、Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白因子，而細胞凋亡是被認為引起腦出血后神經(jīng)功能缺損最重要的機制〔2〕。本研究分析了粒細胞集落刺激因子對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響。

1對象與方法

1.1對象成年雄性SD大鼠60只，由大學動物中心提供。體重280～320 g，鼠齡2～3個月。采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、腦出血組、治療組各20只。根據(jù)6、12、24、48 h斷頭時點不同分為四個亞組各5只。

1.2儀器與試劑儀器：頭顱立體定位儀由大學神經(jīng)生物實驗室提供；電子天平：BS110S型(中國Sartorius)；顯微鏡：Olympus多功能顯微鏡(日本)；病理組織包埋機：中國BMZ-3型；臺式離心機：TGL-16G(上海)；微量注射器：世界精密儀器商貿(mào)(上海)有限公司。試劑rhG-CSF：麒麟鯤鵬(中國)生物藥業(yè)有限公司；Bax、Bcl-2多克隆抗體：武漢博士德公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3處理方法腦出血組、治療組在給予10%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后以俯臥位固定，切開頭皮后采用腦立體定位儀選擇尾狀核(前囟前0.2 mm，中線右側(cè)旁開3 mm，深6 mm)處作為注射點，注入取自尾部的不凝血50 μl，而后緩慢退針，采用骨蠟局部封閉并縫合切口，采用神經(jīng)功能缺損評分，1～4分提示大鼠腦出血模型建模成功。手術后1 h，治療組腹腔注射60 μg/kg rhG-CSF，腦出血組注射等量生理鹽水。假手術組在手術造模時，用等量生理鹽水替代不凝血注射進入顱內(nèi)，術后接受生理鹽水腹腔注射。術畢大鼠自由活動進食進水。

1.4觀察指標

1.4.1腦組織含水量手術后6、12、24、48 h時，采用斷頭法處死大鼠，開顱取出腦組織，取出腦膜、低位腦干和小腦組織，保留大腦組織并用電子天平稱量濕重，而后將腦組織放在恒溫電烤箱中100℃烘烤24 h，使水分充分蒸發(fā)，而后用電子天平稱量干重。參照Elliott公式計算腦組織含水量，含水量為(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.2腦組織中Bax、Bcl-2蛋白含量檢測取腦組織，加入RIPA裂解液抽提蛋白，采用Western印跡檢測蛋白含量，設定手術后6 h時假手術組的蛋白含量為100，計算其他時間點、其他組蛋白含量的相對值。

2結果

2.1腦組織含水量經(jīng)方差分析，三組間腦組織含水量有差異(P<0.05)；LSD兩兩比較顯示，腦出血組大鼠的腦組織含水量高于假手術組，治療組大鼠的腦組織含水量低于腦出血組(P<0.05)。見表1。

2.2腦組織Bcl-2、Bax的蛋白含量三組間腦組織Bcl-2的蛋白含量有差異(P<0.05)；腦出血組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量低于假手術組；Bax蛋白含量高于假手術組治療組大鼠大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量高于腦出血組，Bax含量低于腦出血組(均P<0.05)。見表2，表3。

表1　三組大鼠腦組織含水量比較

表2　三組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白比較

表3　三組大鼠腦組織Bax的蛋白比較

3討論

rhG-CSF能夠動員骨髓干細胞(BMSC)向腦損傷部位遷移并在局部對壞死的腦組織進行修復，進而促進神經(jīng)功能的恢復〔3〕。BMSC在神經(jīng)系統(tǒng)局部能夠產(chǎn)生成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)，促進神經(jīng)元細胞在局部完成黏附、增殖、分化的過程，有利于神經(jīng)功能的修復〔4〕；同時，BMSC也能產(chǎn)生神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，有利于腦出血局部血供重建、神經(jīng)功能的恢復〔5〕。此外，由rhG-CSF動員而募集的BMSC具有抗炎的作用，能夠減輕局部神經(jīng)細胞所受到的損傷〔6〕。

近年來，越來越多的研究報道了rhG-CSF治療腦血管疾病的價值，通過動員BMSC保護神經(jīng)元細胞、修復神經(jīng)功能、緩解腦組織局部水腫〔7〕。腦組織水腫是腦出血后最重要的病理改變，也是造成神經(jīng)功能損傷的關鍵環(huán)節(jié)，通過稱量腦組織的干重和濕重并計算差值可以反映腦組織的水腫程度〔8〕。本研究說明腦出血模型建立后腦組織發(fā)生水腫，而在進行rhG-CSF治療后能夠改善腦組織水腫的情況，有利于神經(jīng)功能的恢復。

細胞凋亡是一種基本的生理現(xiàn)象，對于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要價值，具體是指細胞在內(nèi)外環(huán)境刺激因素作用下發(fā)生的自主有序的死亡過程。該過程有助于清除體內(nèi)異常的細胞并且受到了多種基因的調(diào)控。Bcl家族是體內(nèi)重要的凋亡調(diào)控基因，包括了抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類型，前者的代表是Bcl-2，主要通過作用于線粒體細胞色素C來發(fā)揮抗凋亡的作用〔9〕；后者的代表是Bax，通過與Bcl-2形成異源二聚體來阻斷Bcl-2的抗凋亡作用，啟動細胞凋亡的程序〔10〕。此外，Bcl-2還具有神經(jīng)保護功能，可以保護神經(jīng)細胞免受氧自由基以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的損傷〔11〕。

在腦出血的發(fā)生過程中，腦組織血供中斷且受到局部血腫的壓迫，會激活細胞凋亡的程序，使神經(jīng)功能發(fā)生損傷。在本研究中，通過分析假手術組和腦出血組大鼠腦組織中凋亡調(diào)節(jié)分子的表達量，進一步說明腦出血大鼠模型建立成功，血腫周圍組織中細胞發(fā)生凋亡；而腦出血大鼠在接受rhG-CSF治療后，血腫周圍組織內(nèi)神經(jīng)細胞的凋亡過程受到抑制，有利于神經(jīng)細胞的增殖以及神經(jīng)功能的重建。

本文研究表明，粒細胞集落刺激因子治療能夠改善實驗性腦出血大鼠的腦組織水腫程度、調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2表達、抑制細胞凋亡，可能成為治療腦出血的理想方法。由于自身能力及實驗條件的限制，本文難以深入提示粒細胞集落刺激因子對腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達影響的作用機制，有待于更多的臨床與實驗研究去探索。

4參考文獻

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〔2014-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)