蒙藥嘎日迪－13味丸對(duì)腦缺血大鼠海馬組織白介素－1β、腫瘤壞死因子－α蛋白及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

蒙藥嘎日迪-13味丸對(duì)腦缺血大鼠海馬組織白介素-1β、腫瘤壞死因子-α蛋白及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

陶春林琳宋葆華湯文莉?qū)汈敔栃惙f翟景波劉鑫張冬麗霍萬(wàn)學(xué)劉月英

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼028000)

摘要〔〕目的探討蒙藥嘎日迪-13味丸對(duì)腦缺血大鼠海馬組織炎性細(xì)胞因子白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用枕大池二次注血法至大鼠腦組織缺血損傷模型，在各時(shí)間段斷頭取腦，用ELISA法和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)腦缺血海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量及細(xì)胞凋亡數(shù)量的百分比。結(jié)果與正常組比較，模型組海馬組織中IL-1β和TNF-α升高，細(xì)胞凋亡百分比增多(P<0.05)；與模型組比較，嘎日迪-13味丸組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α含量降低，細(xì)胞凋亡百分比數(shù)減少(P<0.05)。結(jié)論嘎日迪-13味丸能降低大鼠腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，減輕缺血損傷程度，其機(jī)制可能與降低腦組織內(nèi)IL-1β和TNF-α含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕嘎日迪-13味丸；腦缺血；細(xì)胞凋亡；炎性因子

中圖分類號(hào)〔〕R743；R285〔

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳研究項(xiàng)目(NJZY11204)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)

Effect of Mongolian medicine Garidi-13 pill on IL-1β, TNF-αprotein and nerve cell apoptosis of cerebral ischemia hippocampus tissue of rats

TAO Chun, LIN Lin, SONG Bao-Hua,etal.

Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, Inner Mongolia, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Mongolian medicine Garidi-13 pill on inflammatory cytokines interleukin-1β(IL-β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) expression and nerve cell apoptosis of cerebral ischemia hippocampus tissue of rats. MethodsTwo times of blood injection to the cistema magna was used to make the rat model of cerebral ischemia. Brain tissue was acquired at each time point. Flow cytometry and ELISA were used to detect the number of apoptotic cells, IL-1β and TNF-α content in hippocampus tissue. ResultsCompared with normal group, IL-1βand TNF-αin hippocampus were increased, apoptosis percentage number was increased of model group (P<0.05). ConclusionsGaridi-13 can reduce the number of apoptosis nerve cell in ischemia brain tissue and reduce the severity of ischemic injury, its mechanism may be related to reduce IL-1β and TNF-αcontent of brain.

【Key words】Garidi -13 pill; Cerebral ischemia; Cell apoptosis; Inflammatory factor

第一作者：陶春(1960-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)病理學(xué)研究。

嘎日迪-13味丸(又名扎沖十三味丸)是蒙醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)方劑之一，由訶子、制草烏、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、沉香、禹糧土、磁石(煅)、甘草、肉豆蔻 13 味藥組成〔1〕。在蒙醫(yī)臨床上一直用于腦缺血性疾病的治療(腦缺血性疾病在蒙醫(yī)學(xué)中稱之為“薩病”、“白脈病”)，主治半身不遂，左癱右瘓，口眼歪斜，四肢麻木，腰腿不利，言語(yǔ)不清，筋骨疼痛，神經(jīng)麻痹等癥，臨床療效滿意〔2〕。但該藥作用機(jī)理研究尚少，臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限。為明確其抗腦損傷的作用及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用Elisa法和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)腦缺血大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)的變化及細(xì)胞凋亡數(shù)量的百分比。探討嘎日迪-13味丸對(duì)腦缺血損傷的抗炎作用，為其治療腦缺血損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組清潔級(jí)SD大鼠72只，體重180～210 g，雌雄不拘，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)吉2007-0003，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)(環(huán)境溫度24～26℃，濕度60%～70%)，自由飲水，術(shù)前12 h禁食。將大鼠隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、模型組、嘎日迪-13味丸組，各組根據(jù)術(shù)后處死時(shí)間不同再分為模型1、3、5、7 d組和嘎日迪-13味丸1、3、5、7 d組，每組各8只大鼠。

1.2試劑與儀器美國(guó)DB公司生產(chǎn)BD Calibur流式細(xì)胞儀。芬蘭雷勃公司生產(chǎn)的MK3酶標(biāo)儀，Elisa試劑盒購(gòu)自美國(guó)GBD公司提供。嘎日迪-13味丸由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院提供。水合氯醛為天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠產(chǎn)品。Annexin V fitc/pi細(xì)胞雙染試劑盒購(gòu)自上海貝博生物試劑公司。

1.3方法

1.3.1給藥方法嘎日迪-13味丸丸以蒸餾水配制成2%濃度，經(jīng)灌胃給藥，每日一次，每次1.2 ml。模型組均給予蒸餾水。正常對(duì)照組在同一環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3.2模型建立10%水合氯醛(0.35/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠俯臥位固定于操作臺(tái)上，項(xiàng)部備皮，安爾碘常規(guī)消毒。在左右耳根連線中點(diǎn)，沿正中線縱行切開頸部皮膚，暴露枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜，用1 ml注射器針頭刺破環(huán)枕膜并稍稍推進(jìn)到達(dá)枕大池，有腦脊液流出后，由左眼球后靜脈叢抽取0.3 ml無(wú)抗凝自體血，以0.1 ml/min注射速度緩慢將0.15 ml/100 g(體重)的自體不抗凝血注入枕大池。明膠海綿壓迫穿刺點(diǎn)3 min后縫合切口。將大鼠頭低30°俯臥位30 min，以利血液凝固沉積在腦底血管周圍。大鼠保溫復(fù)蘇至清醒后自由飲食飲水。48 h后同法操作制成大鼠腦梗死模型。嘎日迪-13味丸組在手術(shù)第二天開始給嘎日迪-13味丸灌胃。在第2次注射后第1，3、5、7天取腦待檢。

1.3.3模型成功標(biāo)志大鼠蘇醒后按Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分〔3〕。0分：無(wú)明顯神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。在1～3分者為有效模型。觀察期內(nèi)沒入選及死亡的大鼠予以剔除，剩余每組6只。

1.3.4標(biāo)本采集在第2次注血后分別在第1、3、5、7天斷頭處死各組大鼠，取腦海馬組織。手術(shù)在冰盒上進(jìn)行。

1.3.5大鼠腦海馬組織IL-1β、TNF-α蛋白檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α蛋白，方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6大鼠腦海馬組織細(xì)胞凋亡百分率檢測(cè)將大鼠腦海馬組織標(biāo)本置于生理鹽水中，充分吸收水分后，將組織剪切成2～3 mm直徑的小塊，放在單細(xì)胞制備儀中，加1 ml生理鹽水，研磨5 min左右。吸取組織液用10 000目細(xì)胞篩過(guò)濾后，用含0.1%牛血清白蛋白的PBS低速1 000 r/min離心5 min，洗滌2次，棄上清。根據(jù)試劑盒重懸細(xì)胞并標(biāo)記細(xì)胞，嚴(yán)格按照說(shuō)明書，上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白水平與正常組〔IL-1β(18.01±1.86)、TNF-α(11.59±1.91)〕比較，模型組腦海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)量較多，且隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，給予嘎日迪-13味丸治療后，TNF-α和IL-1β表達(dá)均不同程度的減少(P<0.05)，表明嘎日迪-13味丸能夠抑制腦缺血海馬組織炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)。見表1，表2。

時(shí)間點(diǎn)模型組嘎日迪-13味丸組1d組41.17±3.931)24.93±5.643)3d組42.99±3.401)2)27.26±3.312)3)5d組60.41±4.621)2)26.14±4.392)3)7d組97.95±13.891)2)26.22±10.352)3)

與正常組比較：1)P<0.05；與同組前一時(shí)點(diǎn)比較：2)P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較：3)P<0.05，下表同

時(shí)間點(diǎn)模型組嘎日迪-13味丸組1d組27.49±4.431)28.26±1.903)3d組51.82±2.941)2)16.57±22.012)3)5d組64.81±3.781)2)21.88±4.712)3)7d組63.22±4.521)2)21.19±2.152)3)

2.2各組大鼠腦海馬組織細(xì)胞凋亡百分比比較與正常組比較(2.83±0.15)%，模型組大鼠腦海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比顯著增加(P<0.05)，且隨損時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率增多，給予嘎日迪-13味丸治療后，凋亡細(xì)胞百分比降低(P<0.05)，見表3。

時(shí)間點(diǎn)模型組嘎日迪-13味丸組1d組3.75±0.341)1.86±0.213)3d組9.85±2.571)2)3.70±0.962)3)5d組5.20±0.861)2)2.95±0.262)3)7d組17.63±2.631)2)5.77±0.622)3)

3討論

腦缺血性疾病導(dǎo)致的腦缺血損傷，是非常復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其與損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，具體包括興奮性毒性、周圍去極化、炎癥、程序性細(xì)胞死亡等四種主要機(jī)制，這四種機(jī)制往往是相互因果相互影響，其中細(xì)胞凋亡是腦缺血神經(jīng)元損傷的嚴(yán)重結(jié)果〔4〕。盡管不同的機(jī)制參與了腦缺血損傷的病理過(guò)程，越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)是其病理發(fā)展的重要因素。

炎癥是由級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的大量細(xì)胞毒性成分誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和致炎癥酶原產(chǎn)生的結(jié)果，細(xì)胞因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞受體，吸引白細(xì)胞并誘導(dǎo)它們移至腦組織造成損傷，細(xì)胞因子也可直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生有害介質(zhì)〔5〕，所以有研究表明，抑制炎癥反應(yīng)可能也是新的治療缺血性腦血管病的對(duì)策。

腦缺血性損傷首先影響的是細(xì)胞的能量代謝，ATP下降，各種依賴ATP的酶活性下降，能量代謝的異常產(chǎn)生了氧自由基(ROS)和鈣超載，鈣離子大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，損傷線粒體，這二個(gè)因素和一些炎癥介質(zhì)共同協(xié)調(diào)作用，造成組織發(fā)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞因子在其中扮演著重要角色，氧自由基和其他信使激活炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。炎癥本身又產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致惡性循環(huán)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡〔6〕。由上可知，腦缺血后激發(fā)的炎癥反應(yīng)是腦組織損傷的關(guān)鍵，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL-1β)等炎性細(xì)胞因子的作用對(duì)腦缺血損傷有重要意義。

TNF-α在正常腦內(nèi)有低水平表達(dá)，研究顯示，TNF-α屬于前炎癥因子，具有多效促炎性及神經(jīng)毒性作用，是炎癥反應(yīng)的起始因子。腦缺血誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，使腦組織內(nèi)TNF-α表達(dá)大量增加，TNF-α促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，并激活巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性遞質(zhì)，導(dǎo)致白細(xì)胞游走至受損腦組織引發(fā)炎性反應(yīng)，使毛細(xì)血管周圍水腫和白細(xì)胞黏附毛細(xì)血管，并且TNF-α可經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞激活作用，促成凝血狀態(tài)和血管收縮，增加神經(jīng)缺損和組織損傷。TNF-α還對(duì)毛細(xì)血管有直接毒性作用，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加和血-腦脊液屏障(BBB)破壞，加重白細(xì)胞浸潤(rùn)及腦水腫。腦組織缺血后，活化的星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，IL-1β介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，刺激單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，從而加重局部炎癥反應(yīng)。IL-1β還可促進(jìn)白細(xì)胞在炎性部位的聚集，并激活中性粒細(xì)胞使之參與炎癥的發(fā)展，通過(guò)破壞BBB，加重腦水腫〔7〕。以上最終導(dǎo)致了缺血核心區(qū)域不可逆性地?fù)p傷，然而，有研究表明，缺血核心壞死區(qū)和正常組織之間包圍著缺血半暗帶區(qū)，該區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在但功能受損，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的重要形式，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基因調(diào)控下逐步走向死亡的過(guò)程，它是一種生理性死亡，不同于壞死，凋亡是腦損傷的動(dòng)態(tài)進(jìn)行過(guò)程，因此半暗區(qū)不是靜止的，隨時(shí)間推移和治療適宜，其大小也發(fā)生改變，梗死區(qū)可擴(kuò)展到半暗區(qū)，如果及時(shí)或適宜的治療可縮小半暗區(qū)的范圍，這給了治療腦缺血疾病一個(gè)時(shí)間〔8〕，因此一直被國(guó)內(nèi)外醫(yī)務(wù)工作和研究人員關(guān)注。有效抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)顯得至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嘎日迪-13味丸能降低大鼠腦缺血組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，減輕缺血損傷程度，其機(jī)制可能與降低腦組織內(nèi)IL-1β和TNF-α含量有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-06-11修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)