黃芩素對SCC15口腔癌細(xì)胞增殖和Caspase-3活性的影響

黃芩素對SCC15口腔癌細(xì)胞增殖和Caspase-3活性的影響

翟越趙海豐1

(燕山大學(xué)校醫(yī)院，河北秦皇島066004)

摘要〔〕目的探討黃芩素(BAI)對人口腔癌細(xì)胞株 SCC15增殖和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性的影響。方法以噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測BAI在不同濃度(終濃度的50、100、200 μg/ml)不同作用時(shí)間(0、12、24、36、48、60、72 h)條件下對SCC15口腔癌細(xì)胞增殖活性的影響。比色法檢測Caspase-3活性的變化，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。結(jié)果BAI在體外對SCC15細(xì)胞株具有直接抑制增殖作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性，對SCC15細(xì)胞的IC50是153.20 μg/ml。不同濃度BAI處理細(xì)胞后，SCC15細(xì)胞被阻止于G0/G1期，抑制SCC15細(xì)胞分裂而降低其增殖能力。結(jié)論BAI可對人SCC15口腔癌細(xì)胞株的凋亡具有促進(jìn)作用，并且促凋亡作用呈時(shí)間-劑量依賴性。BAI體外具有增加HeLa細(xì)胞Caspase-3活性的作用，能明顯上調(diào)SCC15細(xì)胞中Caspase-3活性，且呈時(shí)間與濃度依賴性。

關(guān)鍵詞〔〕黃芩素；SCC15細(xì)胞；增殖；Caspase-3活性；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)〔〕R737.33〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531664)

1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

第一作者：翟越(1965-)，女，主治醫(yī)師，主要從事口腔醫(yī)療及相關(guān)藥物研究。

黃芩素(BAI)具有多種藥理作用〔1〕。癌癥的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因、多途徑相互作用的結(jié)果，其中細(xì)胞的增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)是引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素〔2〕。目前對于細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系十分受關(guān)注。有關(guān)BAI的一些制劑已在臨床應(yīng)用于上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、慢性阻塞性肺病、傳染性肝炎、細(xì)菌性痢疾等多種疾病的治療，并且療效顯著。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)可催化多種細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的激活〔3〕。裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔4〕。它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著重要功能〔5〕。Caspase-3可經(jīng)細(xì)胞色素C、Caspase-9途徑激活，也可通過另外的途徑激活。最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，Caspase-3活性明顯下降〔5〕。

1材料與方法

1.1材料及儀器SCC15口腔鱗狀癌細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，BAI單體(純度≥9 8%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，南京建成生物工程研究所)，二辛可酸(BCA)蛋白測定試劑盒(Sigma)，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，Galaxy CO2培養(yǎng)箱MiniGalaxy A型(英國RS Biotech公司)，MK3酶標(biāo)儀(中國上海雷勃公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清培養(yǎng)SCC15細(xì)胞，將SCC15細(xì)胞按5×104/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，空白對照組培養(yǎng)正常細(xì)胞不添加處理因素，BAI組分別給予終濃度為50、100、200 μg/ml的BAI進(jìn)行處理。

1.3MTT方法檢測細(xì)胞增殖作用將狀態(tài)良好，生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加0.25%胰酶消化數(shù)分鐘，收集細(xì)胞于2 ml離心管中，700 r/min，離心5 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目，將SCC15細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞完全貼壁，加入不同濃度的黃芩素 (終濃度為)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，陰性對照組加入等體積DMEM完全培養(yǎng)液，設(shè)空白調(diào)零孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、72 h，棄去上清，用DMEM洗3次，洗去藥物，每孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，10 min后于酶標(biāo)儀492 nm處測OD值，計(jì)算藥物的體外生長抑制率，用細(xì)胞生長抑制率對藥物作用時(shí)間繪制回歸曲線，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組平均OD值-用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.4MTT檢測Caspase-3活性的變化取對數(shù)生長期細(xì)胞(5×105/ml)，對照組不添加藥物，試驗(yàn)組加入不同濃度BAI(終濃度為50、100、200 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48和72 h后，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，棄上清；在收集的沉淀細(xì)胞中加入50 μl冰上預(yù)冷的Lysis Buffer；置冰上裂解20 min，蝸旋振蕩至澄清，4℃，10 000 r/min，離心1 min；把離心上清液轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上；測定蛋白濃度；吸取50 μl含50～200 μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，如體積不足50 μl用Lysis Buffer補(bǔ)足至總體積50 μl；加入50 μl的2×Reaction Buffer；加入5 μl Caspase-3 Substrate，37℃避光孵育4 h；用酶標(biāo)儀，在405 nm處測定其吸光值。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化取對照組、BAI(終濃度200 μg/ml)處理48 h后的SCC15細(xì)胞單細(xì)胞懸液(1×106/ml)1 ml，SCC15細(xì)胞上清倒入標(biāo)記試管中，培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶消化，消化的SCC15細(xì)胞加入對應(yīng)的試管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。0.01 mol/L pH 7.2，PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min。將70%乙醇緩慢滴入試管中，邊滴邊搖動(dòng)試管，使SCC15細(xì)胞分散、固定，置4℃?zhèn)溆?。將上述固定的SCC15細(xì)胞離心去上清，用0.01 mol/L pH7.2 PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min。取200 μl單細(xì)胞樣品(1×106/ml)，加200 μl RNase溶液(10 μg/ml)，37℃水浴搖床30 min。將細(xì)胞過濾，去除聚積成團(tuán)細(xì)胞，加入膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin V-FITC)液5 μl和碘化丙啶(PI)液10 μl，混勻，室溫避光染色15 min。PBS洗2次，去除多余染料，流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm)。

2結(jié)果

2.1BAI對SCC15口腔癌細(xì)胞株生長抑制作用BAI在體外對SCC15細(xì)胞株具有直接的抑制增殖作用，并且呈時(shí)間和劑量依賴性。利用回歸曲線，BAI對SCC15細(xì)胞的IC50是153.20 μg/ml。見表1，圖1。

2.2BAI對Caspase-3活性的影響50 μg/ml劑量的AAD作用12 h，Caspase-3活性并不明顯上升，作用24 h后，Caspase-3活性才開始增加；作用72 h，Caspase-3活性明顯增加；100和200 μg/ml AAD作用12 h，Caspase-3即開始增加，24 h時(shí)，與對照組比較顯著增加(P<0.01)，至72 h Caspase-3顯著增加；而125 μg/ml的BAI作用24 h，Caspase-3活性即增加明顯，隨著濃度和作用時(shí)間的增加，Caspase-3顯著增加，呈時(shí)間與濃度依賴性。見表2。

2.3BAI對細(xì)胞周期的影響B(tài)AI(終濃度200 μg/ml)誘導(dǎo)SCC15細(xì)胞48 h后，處于G0/G1期的SCC15細(xì)胞數(shù)由對照組的59.26%增加到67.36%和64.26%，而處于S期的細(xì)胞數(shù)，由對照組的25.88%減少到20.57%和21.67%，說明SCC15細(xì)胞被阻止于G0/G1期，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)都減少，而未經(jīng)BAI作用的SCC15細(xì)胞增殖正常，提示BAI通過抑制SCC15細(xì)胞分裂而降低其增殖能力。

組別OD值抑制率(%)對照組0.84±0.01-50(μg/ml)0.69±0.021)17.19100(μg/ml)0.54±0.032)40.56200(μg/ml)0.42±0.012)50.73

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

圖1　黃芩素對SCC15細(xì)胞生長抑制作用

組別12h24h48h72h對照組0.08±0.010.10±0.020.13±0.020.20±0.0150(μg/ml)0.09±0.020.13±0.010.19±0.030.29±0.02100(μg/ml)0.16±0.010.24±0.021)0.42±0.031)0.69±0.021)200(μg/ml)0.24±0.031)0.40±0.041)0.52±0.051)0.90±0.091)

與對照組比較:1)P<0.01

3討論

口腔癌是頜面部常見的黏膜上皮腫瘤，多發(fā)于40～60歲人群，以舌、頰、牙齦以及腭等為好發(fā)病部位，以鱗狀細(xì)胞癌為主要病理類型，約80%〔6〕。早期的口腔癌主要為局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，到達(dá)晚期時(shí)會(huì)逐漸發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔7〕。該病惡性度較高，目前仍無有效治療手段，治療仍以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療等措施為主。本研究也發(fā)現(xiàn)，BAI對SCC15口腔鱗狀細(xì)胞癌的活力的抑制作用十分顯著，且BAI濃度越高，對SCC15細(xì)胞的抑制作用越明顯，并呈劑量依賴性。本試驗(yàn)通過對SCC15細(xì)胞Caspase-3活性的分析表明，BAI體外具有增加SCC15細(xì)胞Caspase-3活性的作用。BAI能明顯上調(diào)SCC15細(xì)胞Caspase-3活性，并且這種作用呈時(shí)間與濃度依賴性，本文為BAI在口腔鱗狀細(xì)胞癌治療中作用的研究提供新的思路。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-11-07修回〕

(編輯袁左鳴)