谷胱甘肽修飾的SiO2 ＠Au 核殼填料的制備及其作為毛細管液相色譜和加壓電色譜固定相的性能評價

汪 慧， 薛 蕓， 魯陽芳， 谷 雪， 王 彥 ， 閻 超

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240）

近年來，隨著代謝組學(xué)、食品藥品科學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)域?qū)Ψ蛛x分析技術(shù)要求的不斷提高，對作為液相色譜核心技術(shù)的色譜填料也提出了更高的要求。作為新一代的色譜填料，核殼填料憑借高比表面積和低傳質(zhì)阻力的特點，具有低反壓、高柱效的獨特優(yōu)勢，逐漸成為新型色譜填料領(lǐng)域研究的熱點［1，2］。SiO2＠Au 核殼顆粒是一種貴金屬核殼顆粒，它是由Au 殼包覆SiO2形成的特殊結(jié)構(gòu)，具有很高的光學(xué)可調(diào)性及良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)［3］、光學(xué)［4］等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在色譜領(lǐng)域，SiO2＠Au 核殼顆粒應(yīng)用比較少。Qu 等［5］制備了SiO2＠Au-C18 反相型核殼填料，并利用加壓毛細管電色譜證明該色譜填料不僅具有良好的分離能力，且pH 適用范圍很廣（pH ＝1 ～14），與傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的填料適用pH 范圍（pH ＝2 ～8）相比，具有耐酸耐堿的優(yōu)勢，由此可見SiO2＠ Au 核殼顆粒在色譜領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

由于Au 顆粒具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易鍵合等特點［6］，SiO2＠Au 核殼顆粒的表面可以進行各種衍生，根據(jù)鍵合基團種類的不同，可以制成不同性質(zhì)的色譜填料。親水性色譜填料是色譜填料中開發(fā)比較晚，但是發(fā)展較迅速的一種，它的出現(xiàn)為反相色譜填料做了一個很好的補充，且在分離極性化合物方面有著很大的優(yōu)勢［7，8］。親水填料制備的固定相主要包括硅膠、整體柱和化學(xué)鍵合固定相。兩性離子固定相作為化學(xué)鍵合固定相的一種，廣泛應(yīng)用于多肽、糖苷等極性物質(zhì)的分離分析中［9］。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種含有兩性離子的化合物，有研究表明，表面鍵合谷胱甘肽的填料具有親水、離子交換等復(fù)雜的分離機理［10］，對強極性物質(zhì)有很好的分離。目前，在SiO2＠ Au 核殼顆粒的表面鍵合谷胱甘肽的填料還未見報道。

制備SiO2＠Au 核殼顆粒最為常用的方法是自組裝-化學(xué)鍍法［11-13］，該方法最關(guān)鍵的步驟即為二氧化硅表面的氨基化。傳統(tǒng)的二氧化硅表面修飾方法主要是用硅烷化試劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）或者3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（3-aminopropyl trimethoxysilane，APTMS）在二氧化硅表面鍵合上氨基，但是由該種方法制備的SiO2＠Au 核殼材料的Au 的包覆量低，而且均勻性也比較差［14］。本文利用醛基與氨基的席夫堿反應(yīng)，引入含高密度氨基的聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI），大大提高了SiO2表面的氨基量；并優(yōu)化了制備SiO2＠Au 核殼填料的條件，改善了Au 納米顆粒容易聚集的現(xiàn)象，制備了Au 覆蓋率較高、較均勻的SiO2＠Au 核殼填料，并在SiO2＠Au 核殼填料的表面鍵合上谷胱甘肽，成功制備了填充了該種填料的毛細管柱，最后利用毛細管液相色譜（cLC）和加壓毛細管電色譜（pCEC）對制備的毛細管柱的親水性能進行了初步的研究和探索。

1 實驗部分

1.1 儀器和耗材

甲醇、乙腈（色譜純）；檸檬酸鈉、正硅酸四乙酯、氯金酸、硫脲、咖啡因、茶堿、胸腺嘧啶、無水甲苯、甲醛、PEI（mean relative molecular mass （Mav）＝70 000）、APTES（純度98%）、碳酸鉀、戊二醛、GSH（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（常熟市楊園化工有限公司）；氨水（平湖化工試劑廠）；水為二次蒸餾水。

掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，SEM，Sirion 200，USA）；透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM，JEM 2010HT，Japan）；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR，Nicolet Fourier，USA）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定蘭格恒流泵有限公司）；加壓毛細管電色譜儀（TriSepTM-2100，上海通微分析技術(shù)有限公司）。

1.2 金溶膠的制備

本實驗采用檸檬酸鈉還原法［15］制備了穩(wěn)定且粒徑可控的金溶膠納米顆粒，具體過程為：取0.01%（m／m）氯金酸水溶液100 mL，加熱至沸騰后，加入1%（m／m）檸檬酸鈉水溶液2 mL，繼續(xù)加熱反應(yīng)使溶液依次呈現(xiàn)灰色-黑色-淡酒紅色的顏色變化。將反應(yīng)結(jié)束后的金溶膠置于4 ℃冰箱中保存，備用。取少量最終穩(wěn)定的淡酒紅色溶液，滴加至鍍碳銅網(wǎng)上，烘干后進行透射電子顯微鏡表征。

1.3 單分散SiO2 微球的制備

本研究在改進的兩相溶膠-凝膠法［16］的基礎(chǔ)上制備了單分散的無孔二氧化硅微球，制備過程如下：取超純水-無水乙醇-氨水（10 ∶3.1 ∶10，v／v／v）混合液6 mL，迅速加入正硅酸四乙酯2 mL，機械攪拌反應(yīng)30 min 后，以1 ∶3 （v／v）的比例緩慢滴加適量的正硅酸四乙酯和超純水-無水乙醇-氨水（10 ∶3.1 ∶10，v／v／v）混合液。滴加結(jié)束后進行陳化；陳化結(jié)束后離心，用乙醇洗滌所得固體，然后干燥備用。取少量所得固體分散至無水乙醇中，超聲分散后滴加至鋁箔上，烘干后進行掃描電子顯微鏡表征。

1.4 SiO2 微球表面修飾聚乙烯亞胺分子

本研究利用醛基和氨基之間的席夫堿反應(yīng)在SiO2微球表面引入聚合物分子PEI，以提高微球表面的氨基含量。首先，利用硅烷化試劑的水解反應(yīng)，將含有氨基的APTES 分子修飾到SiO2微球表面：取SiO2微球1 g，超聲分散至100 mL 無水甲苯中，加入APTES 溶液，于120 ℃下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后用甲苯、無水乙醚依次洗滌；然后，通過氨基與戊二醛之間的席夫堿反應(yīng)，使SiO2微球表面含有醛基：將上述APTES 修飾的SiO2微球超聲分散至冰乙酸-甲醇（298 ∶2，v／v）溶液中，加入3 mL 戊二醛，室溫下磁力攪拌反應(yīng)9 h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，用甲醇洗滌除去多余的戊二醛，即得戊二醛修飾的SiO2微球。最后，利用SiO2微球表面醛基與聚乙烯亞胺分子之間的席夫堿反應(yīng)，將聚乙烯亞胺分子接枝到SiO2微球表面：將上述戊二醛修飾的SiO2微球重新分散至冰乙酸-甲醇（298 ∶2，v／v）溶液中，加入1 g 聚乙烯亞胺，室溫下磁力攪拌反應(yīng)9 h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，用甲醇清洗后，將所得固體置于60 ℃真空干燥箱中干燥，即得聚乙烯亞胺分子修飾的SiO2微球，標(biāo)記為SiO2＠PEI70000。

1.5 SiO2＠Au 核殼微球的制備

本研究通過自組裝-化學(xué)鍍法制備了SiO2＠Au核殼微球，主要流程包括兩個步驟：（1）SiO2微球表面Au 種子化。取0.03 g 上述SiO2＠PEI70000微球超聲分散至超純水中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH 值為8，再加入25 mL Au 溶膠，反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束之后用純水離心洗去多余的Au 溶膠，即得Au 種子化SiO2微球。（2）SiO2微球表面Au 殼層的形成。取2.5 mL 氯金酸溶液（6 mmol／L）溶解在124 mL 超純水中，磁力攪拌反應(yīng)40 min，置于4 ℃冰箱中過夜進行陳化，得金陳化液。將上述制得的Au 種子化SiO2微球分散至24 mL 上述陳化液中，磁力攪拌條件下迅速加入40 μL 的甲醛溶液，于25 ℃條件下反應(yīng)9 h，反應(yīng)結(jié)束之后用純水離心洗去多余的陳化液和甲醛，得金納米顆粒包覆的SiO2微球，標(biāo)記為SiO2＠Au 核殼微球。

1.6 SiO2＠Au 核殼微球表面修飾GSH 分子

本研究利用巰基和金顆粒之間的特異配位作用，將含有巰基的GSH 分子修飾在SiO2＠ Au 表面，制備了一種新型的兩性離子型親水色譜填料SiO2＠Au-GSH。制備流程為：取SiO2＠Au 核殼微球約0.1 g，加入到40 mL 谷胱甘肽（20 mmol／L）水溶液中，加鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液至pH 為3。避光條件下磁力攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾、水洗，置于60 ℃真空干燥箱中烘干備用。

1.7 SiO2＠Au-GSH 親水色譜柱的制備與表征

采用高壓勻漿法將上述制備得到的SiO2＠Au-GSH 色譜填料填充至熔融石英毛細管（100 μm i. d.）中，得到有效長度12 cm（總長40 cm）的毛細管色譜柱。燒制兩端柱塞和窗口后，安裝至加壓毛細管電色譜系統(tǒng)中進行色譜表征。測試樣品為0.1 mmol／L 的咖啡因、茶堿和胸腺嘧啶混合樣品，流動相為不同比例的乙腈和20 mmol／L 磷酸鹽緩沖液混合溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 金溶膠的制備

本實驗在改進的檸檬酸鈉還原氯金酸的方法基礎(chǔ)上制備了金溶膠。該方法成本低、設(shè)備簡單、反應(yīng)時間短且操作簡便。圖1 為優(yōu)化條件下制備得到的粒徑約20 nm 的金溶膠納米粒子的透射電鏡結(jié)果，表明通過該方法制備的納米金溶膠粒子粒徑均一、單分散、比表面積較大，適于用作核殼材料的殼層粒子。

圖1 金溶膠納米顆粒的透射電子顯微鏡圖Fig.1 TEM image of nanometer gold particles

2.2 單分散SiO2 微球的制備

本研究利用改進的溶膠-凝膠方法制備了球形單分散的SiO2微球。圖2 為采用該方法制備得到的SiO2微球的掃描電鏡結(jié)果，該結(jié)果表明制備得到的SiO2微球表面光滑、球形均勻、單分散且粒徑約1 μm，適合作為核微球制備μm 級核殼材料。

2.3 SiO2＠Au 核殼微球的制備

2.3.1 SiO2＠Au 核殼微球的制備原理

圖2 二氧化硅微球的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 SEM image of micrometer SiO2

本研究通過自組裝-化學(xué)鍍法制備了SiO2＠Au核殼微球。如圖3 所示，主要流程包括3 個步驟：（1）SiO2微球表面的修飾：在SiO2微球表面鍵合上氨基，使Au 顆粒能夠吸附在SiO2微球的表面。（2）Au 種子化SiO2的形成：在已經(jīng)被修飾的SiO2混懸液中加入Au 溶膠，使小粒徑的Au 溶膠顆粒初步吸附在SiO2微球的表面。（3）Au 種子化SiO2的成長：先配制含有Au 離子的陳化液，然后用還原劑甲醛將陳化液中的Au 離子還原，被還原的Au 借助成核部位Au 種子不斷生長，最終形成完整的Au 殼層。

2.3.2 SiO2＠Au 核殼微球的制備條件優(yōu)化

本實驗主要從Au 種子化SiO2的形成和Au 種子化SiO2的成長兩個階段進行條件優(yōu)化。在SiO2微球表面Au 種子化階段，重點考察了不同pH 值（分別為4、8、10）對SiO2微球表面Au 種子化的影響；在SiO2微球表面Au 殼層形成階段，重點優(yōu)化了不同甲醛溶液用量（分別為20、30、40 和50 μL）對SiO2微球表面Au 殼層形成的影響。

圖3 SiO2＠Au 核殼微球的制備Fig.3 Preparation of SiO2＠Au core-shell particles

不同pH 值對SiO2微球表面Au 種子化的影響：不同的pH 條件可以影響SiO2微球表面和Au表面的靜電吸附能力。過酸或者過堿條件下，Au 顆粒與SiO2微球表面的結(jié)合能力都會下降。由圖4可以看出，在pH 分別為4 和10 條件下，SiO2表面Au 的鍵合量都很低；在pH 8 條件下，Au 的吸附量比較高，分布也比較均勻，進一步證明合適的pH 值有助于Au 顆粒在SiO2表面的吸附。所以本實驗選擇的反應(yīng)pH 值為8。

甲醛溶液用量對SiO2微球表面Au 殼層形成的影響：甲醛的主要作用是還原金陳化液中的Au離子，被還原的Au 借助成核部位的Au 種子不斷生長，最終在SiO2微球表面形成完整的Au 殼層。在一定量的金陳化液條件下，甲醛過多或過少都會對Au 殼層的形成有一定的影響。如圖5a 和圖5b 所示，甲醛溶液的加入量分別為20 μL 和30 μL，相對較少，這樣會導(dǎo)致還原的Au 量不夠，從而使得殼層Au 的密度不大。但是甲醛溶液太多，如圖5d 所示，當(dāng)甲醛加入量為50 μL 時，被還原的Au 量也會隨之增多，這樣會造成Au 團聚，使得Au 吸附很不均勻。從圖5c 可以看出，在甲醛量為40 μL 條件下，形成的Au 殼層比較均勻，覆蓋率也比較高。所以本實驗選擇的甲醛量為40 μL。

2.4 SiO2＠Au 核殼微球表面修飾GSH

圖4 不同pH 條件下制備得到的Au 種子化SiO2 微球的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of gold-seeded silica microspheres prepared at different pH values

圖5 不同甲醛用量制備的SiO2＠Au 核殼填料的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 SEM images of SiO2＠Au microspheres prepared with different contents of formaldehyde

還原型谷胱甘肽極易受到外界環(huán)境影響而產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽，有文獻表明在偏酸性條件下谷胱甘肽的穩(wěn)定性比較好，所以本實驗考察了不同pH對谷胱甘肽在SiO2＠Au 核殼填料的Au 表面的吸附量的影響。圖6 為不同pH 條件下制備得到的SiO2＠Au-GSH 核殼填料的FTIR 表征結(jié)果。與pH 2 和pH 4 條件下結(jié)果比較，pH 3 時制備得到的SiO2＠Au-GSH 核殼填料有明顯的Si-O-Si 的伸縮振動峰（1 080 cm-1和795 cm-1）和-COOH 峰（3 400 cm-1）、C＝O 峰（1 720 cm-1）、-CH2峰（2 920 cm-1）、-NH2峰（3 300 ～3 400 cm-1），表明在pH 3 條件下還原型谷胱甘肽能夠被成功地鍵合到SiO2＠Au 微球表面。

2.5 SiO2＠Au-GSH 親水色譜柱的表征

類似于典型的硫代甜菜堿型和磷酸膽堿型兩性離子親水色譜功能單體，谷胱甘肽結(jié)構(gòu)中同時含有帶正電荷的氨基和帶負電荷的羧基，且結(jié)構(gòu)本身具有良好的親水性，因此可以作為良好的兩性離子親水色譜功能單體，使色譜填料具有很高的親水性和良好的分離選擇性。圖7 為不同有機溶劑含量條件下，該SiO2＠ Au-GSH 色譜柱對3 種強極性化合物——咖啡因、茶堿和胸腺嘧啶的保留情況。在不同的ACN 濃度下，3 種物質(zhì)保留時間的重復(fù)性（RSD）小于1.5%。

圖6 不同pH 條件下制備得到的SiO2＠Au-GSH核殼填料的FTIR 表征結(jié)果Fig.6 FTIR spectra of SiO2＠Au-GSH prepared at different pH values

由圖7 可以看出，在高有機相比例（≥80%，v／v）流動相條件下，隨著水相比例的減小，3 種強極性化合物的保留增強，且隨著化合物分子極性的不斷增強（咖啡因＜茶堿＜胸腺嘧啶），其保留時間也越長。這個結(jié)果表明該SiO2＠Au-GSH 色譜柱對強極性化合物具有良好的親水色譜保留能力。但在有機相比例＜80% 條件下，卻沒有體現(xiàn)出親水性能，可能在這一條件下存在更為復(fù)雜的分離機理。

圖7 流動相中乙腈含量對咖啡因、茶堿、胸腺嘧啶保留時間的影響Fig.7 Effect of acetonitrile content in the mobile phase on the retention times of caffeine，theophylline and thymine

加壓毛細管電色譜是在毛細管液相色譜和毛細管電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型的分離分析技術(shù)，具有高柱效、高選擇性、高分辨率和快速分離的獨特優(yōu)勢。在親水作用色譜體系中，流動相含有比例較高的有機溶劑，這與非水毛細管電泳的電泳介質(zhì)有些類似。因此，我們將該親水毛細管色譜柱應(yīng)用于水含量很少（5% 水）的加壓毛細管電色譜分離系統(tǒng)，并比較了在色譜柱進口端施加不同電壓情況下3 種強極性化合物的分離情況。由圖8可以看出，進口端施加負電壓時，3 種帶正電荷的強極性化合物在親水色譜和電場的雙重分離機理作用下能夠得到很好的分離，體現(xiàn)了該SiO2＠Au-GSH 親水色譜柱在非水加壓毛細管電色譜系統(tǒng)中對強極性化合物分子的分離優(yōu)勢。

圖8 不同電壓下3 種堿性物質(zhì)的分離色譜圖Fig.8 Chromatograms of three alkaline components under different applied voltages

3 結(jié)論

本研究通過引入聚乙烯亞胺聚合物分子，建立了一種表面金覆蓋率高的SiO2＠Au 核殼填料的制備方法；并利用金和巰基的特異配位作用，制備了一種新型的兩性離子親水作用SiO2＠Au-GSH 核殼色譜填料。加壓毛細管電色譜表征結(jié)果顯示，SiO2＠Au 色譜柱對強極性化合物具有很好的分離能力，為代謝組學(xué)、中藥復(fù)雜有效成分的分離提取等提供了一種新的分離手段。

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