Apigenin對黃嘌呤氧化酶活性抑制的實驗研究

林偉青 謝建祥 王雅娟 王海東#

（1江西省人民醫(yī)院 南昌330006；2江西省兒童醫(yī)院 南昌330006；3江西省豐城市石灘中心醫(yī)院 豐城331100）

隨著我國經(jīng)濟發(fā)展及人口老齡化，痛風(fēng)發(fā)病率有明顯增高趨勢。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛風(fēng)的基本病因是嘌呤代謝紊亂，血（尿）中嘌呤代謝最終產(chǎn)物-血尿酸持續(xù)增高。治療痛風(fēng)多采用秋水仙堿、非甾體類抗炎藥、黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑等西藥治療，這些藥物能在一定程度上控制癥狀、穩(wěn)定病情，但由于藥物的不良反應(yīng)，及對體內(nèi)病理性產(chǎn)物缺乏進(jìn)行清除轉(zhuǎn)化的綜合治療方法，難以達(dá)到理想的結(jié)果。別嘌呤醇是我們在臨床上最常使用的黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑，但是，由于別嘌呤醇可能導(dǎo)致較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如肝炎、超敏變態(tài)反應(yīng)等，導(dǎo)致患者因害怕不良反應(yīng)而依從性較差，因此探尋更安全有效的制劑，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，是我們面臨的一項課題。

Apigenin（芹菜素）即 4，5，7-三羥基黃酮，在各種蔬菜、水果以及中草藥中廣泛存在，具有抗病毒、抗菌、降壓、預(yù)防動脈粥樣硬化、抑制腫瘤細(xì)胞生長等多種生理活性，并且具有無變異、安全無毒的特性。有報道稱其具有抑制和治療多種腫瘤的潛能，在各種腫瘤治療的研究中廣泛使用，而對其它疾病的治療方面少有研究。本課題通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)Apigenin對黃嘌呤氧化酶有較強的抑制作用，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行更為詳細(xì)的體外酶學(xué)試驗，從而研究其對黃嘌呤氧化酶活性的影響?，F(xiàn)報告如下：

1 實驗材料

1.1 儀器 R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（東京理化）、紫外分光光度計（島津UV1800型）、電子天平、876A-2型數(shù)顯真空干燥箱。

1.2 試劑 Apigenin（上海純優(yōu)生物科技有限公司），黃嘌呤氧化酶（sigma公司），黃嘌呤（sigma公司），別嘌呤醇（sigma公司），磷酸二氫鉀（分析純）磷酸氫二鈉（分析純）。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

2.1.1 磷酸鹽緩沖液 （PBS）的配制 精密稱取KH2PO42.72 g和Na2HPO414.20 g，加蒸餾水50 ml，配成0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH值調(diào)至7.5 。

2.1.2 別嘌呤醇（A）液配制 精密稱取別嘌呤醇mg，用 PBS（pH=7.5）100 ml溶解，配制成濃度為 2 μg/ml的別嘌呤醇液。

2.1.3 黃嘌呤（X）液配制 精密稱取氫氧化鈉0.0 g，用8 ml蒸餾水溶解，得氫氧化鈉溶液，再加入精密稱取的黃嘌呤0.057 g，得到黃嘌呤氫氧化鈉溶解液（a液）。精密稱取磷酸二氫鉀0.27 g，用10 ml蒸餾水溶解，得到磷酸二氫鉀液（b液）。將a液、b液混合后加蒸餾水稀釋至40 ml，再用PBS（pH=7.5）稀釋至 100 ml。精密量取 8 ml，再用 PBS（pH=7.5）稀釋至66.667 ml，即得1 mmol/L的X液。

2.1.4 黃嘌呤氧化酶（XO）液配制 精密量取黃嘌呤氧化酶40 μl（1 U），用PBS（pH=7.5）稀釋至2 ml，即得0.5 U/ml的XO液。

2.1.5 Apigenin液配制 用二甲亞礬（DMSO）50 μl溶解1 mg Apigenin后，加磷酸鹽緩沖液（pH=7.5）配制成0.4 mg/ml的Apigenin溶液（DMSO最終濃度＜1%）。

2.2 黃嘌呤氧化酶抑制實驗

2.2.1 吸光度值每分鐘變化值A(chǔ)值的測定 取400 μl 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液分別加入濃度為1 mmol/L 的 X 液 60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，振蕩2 min后加入0.1 U即200 μl黃嘌呤氧化酶液（已預(yù)溫至25℃）渦旋混勻后，用紫外分光光度計測量292 nm處該反應(yīng)體系在不同時間點的吸光度值，連續(xù)測定15 min，每分鐘測定1次，測定吸光度值每分鐘變化值（A）。

2.2.2 吸光度值每分鐘變化值B值的測定 在60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl濃度為 1 mmol/L的X液的各試管中加入濃度為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 300 μl，再分別加入 Apigenin 液各 12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl，陽性對照加入別嘌呤醇液各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl； 空 白 對 照 則 加 入DMSO 各 12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl；然后，在每個試管中加入濃度為0.5 U/ml的XO液200 μl，各試管的溶液總體積為1 ml。

2.2.3 黃嘌呤氧化酶 （XO）活性的計算 以公式（1－B/A）×100%，計算各樣本對XO的活性抑制百分率。

2.2.4 抑制動力學(xué)參數(shù)Ki值計算 用Dixon繪圖法計算Ki值，以樣品濃度為自變量，反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量，在兩種不同濃度的底物下，得到兩條直線，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包計算回歸方程，求出兩直線的交點的X軸值，即可得到抑制動力學(xué)參數(shù)Ki值。

3 實驗結(jié)果

3.1 Apigenin對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Apigenin顯著抑制了尿酸的生成，并與濃度相關(guān)，是黃嘌呤氧化酶的混合型抑制劑，與空白組對照差異性顯著，P＜0.01。見圖1。

圖1 Apigenin對黃嘌呤氧化酶的Linweaver-Burk曲線

3.2 各樣品對XO的抑制效果 將各樣品濃度與平均抑制率進(jìn)行線形回歸，然后根據(jù)回歸方程計算抑制率I=50%時C的值，即為半數(shù)抑制濃度IC50。見表1。

表1 各樣品對XO的抑制效果

3.3 Ki值計算 用Dixon繪圖法計算Ki值：以樣品濃度為自變量，反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量，在兩種不同濃度的底物下，得到兩直線，再用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包計算回歸方程，計算出兩直線的交點的X軸值，可得到抑制動力學(xué)參數(shù)Ki。見圖2～3。

圖2 黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中Apigenin的Dixon圖

圖3 黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中別嘌呤醇的Dixon圖

4 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Apigenin能有效抑制黃嘌呤氧化酶活性，并且與濃度相關(guān)，為進(jìn)一步進(jìn)行動物實驗及臨床研究打下了基礎(chǔ)。Apigenin是一種廣泛存在的黃酮類化合物，在各種植物蔬菜、水果、豆類中含量豐富，尤其在芹菜中含量最高。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎癥[1]、降低血壓[2]、抗焦慮[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]以及抗腫瘤[7～8]等作用。

近年來國內(nèi)外許多學(xué)者研究報道，一些植物化學(xué)成分對黃嘌呤氧化酶具有很強的抑制作用，F(xiàn)lemmig等[9]研究發(fā)現(xiàn)一種黃酮類化合物（flavone aglycone apigenin）和木犀草素（luteolin）等對黃嘌呤氧化酶的抑制作用明顯強于別嘌呤醇（其Ki值遠(yuǎn)低于別嘌呤醇）；Arimboor等[10]發(fā)現(xiàn)一種提取自印度植物種子中的黃酮類化合物（Tetrahydroamentoflavone）在黃嘌呤氧化酶抑制實驗中也有著較強的黃嘌呤氧化酶抑制作用，其IC50值為92 nM，Ki值為0.982 μM，與別嘌呤醇差距不大（別嘌呤醇IC50值為100 nM，Ki值為 0.612 μM）；Lin 等[11]報道有一種二萜類化合物（sugiol）對黃嘌呤氧化酶也有明顯的抑制作用，其IC50值為（6.8±0.4）μM。下一步我們將在此基礎(chǔ)上，嘗試通過動物實驗及臨床研究進(jìn)一步研究其黃嘌呤氧化酶抑制作用、藥代動力學(xué)以及安全性，以期能找到更安全有效的痛風(fēng)治療方法。

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