N-cadherin通過β-catenin調(diào)控雞胚脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射①

楊慈清李小英　王聰睿張必超　李　晗　林俊堂(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003)

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N-cadherin通過β-catenin調(diào)控雞胚脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射①

楊慈清②李小英王聰睿②張必超李晗林俊堂③
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003)

［摘要］目的:闡明雞胚發(fā)育過程中神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在脊髓連合纖維發(fā)育中的作用。方法:在雞胚發(fā)育第3天(stage22)，將N-cadherin和β-catenin干擾載體通過活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入脊髓，電轉(zhuǎn)后繼續(xù)培養(yǎng)3 d(stage29)，取材、固定、包埋和切片。分為N-cadherin干擾組、β-catenin干擾組，β-catenin和N-cadherin共同干擾組以及轉(zhuǎn)染pGU6-GFP-neo表達(dá)質(zhì)粒對照組;采用熒光免疫組織化學(xué)法檢測N-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)變化;根據(jù)GFP表達(dá)結(jié)果，觀察脊髓連合纖維的投射情況。結(jié)果:在雞胚發(fā)育過程中，在脊髓抑制N-cadherin的表達(dá)會(huì)降低β-catenin的表達(dá);在N-cadherin抑制表達(dá)72 h后觀察到脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射產(chǎn)生被抑制;抑制β-catenin表達(dá)出現(xiàn)類似向?qū)?cè)投射障礙; N-cadherin和β-catenin同時(shí)被干擾時(shí)，連合纖維投射的抑制效果相似。結(jié)論: N-cadherin參與調(diào)控脊髓連合纖維的發(fā)育過程，其部分作用機(jī)制可能是通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

［關(guān)鍵詞］雞胚;神經(jīng)鈣黏蛋白;β-連環(huán)蛋白;神經(jīng)纖維

①本文受2013年河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A320866)、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金(2013QN125)、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金(2013QN115)和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金(505090)資助。

②河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453003。

N-cadherin regulates projection of spinal commissural axons via β-catenin during chicken embryonic development

YANG Ci-Qing，LI Xiao-Ying，WANG Cong-Rui，ZHANG Bi-Chao，LI Han，LIN Jun-Tang.College of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

［Abstract］Objective: To explore the role of N-cadherin and β-catenin in the formation of spinal commissural axon projection during chicken embryonic development.Methods: Fertilized eggs were cultured for three days(stage22)，N-cadherin or β-catenin interference plasmid was injected into the neural tube and in vivo electroporation was performed.Three days after the electroporation，embryos were collected，fixed with 4% PFA，embeded with OCT，and cut into frozen sections.Four groups (knockdown of N-cadherin or βcatenin or both of them，and control) were included in this study.Immunohistochemistry method was used to analyze the protein expression result of N-cadherin or β-catenin.The changes of spinal commissural projections were observed with GFP fluorescence.Results: During chicken embryonic development，knockdown of N-cadherin inhibited the expression of β-catenin in the spinal cord.The commissural nerve fibers projecting to the contralateral side of the spinal cord was impaired after knockdown of N-cadherin or β-catenin; this phenotype was similar after knocking down both of them.Conclusion: N-cadherin is implicated in the formation of spinal commissural projection in the developing spinal cord，possibly via β-catenin.

［Key words］Chicken embryonic; Neural cadherin;β-catenin; Nerve fibers

神經(jīng)系統(tǒng)具有左右對稱的結(jié)構(gòu)特征，連合纖維是系統(tǒng)兩側(cè)信息交換的主要形式。在雞胚發(fā)育過程中，脊髓兩側(cè)的神經(jīng)纖維也存在交互向?qū)?cè)的投射，即脊髓的連合纖維［1］。楊琳等［2］曾以成年大鼠作為動(dòng)物模型，應(yīng)用辣根過氧化物酶逆行標(biāo)記脊髓連合纖維，證明了在哺乳動(dòng)物脊髓中也存在神經(jīng)纖維的投射。在胚胎發(fā)育過程中，連合纖維神經(jīng)元產(chǎn)生于神經(jīng)管的背側(cè)，在向腹側(cè)遷移過程中發(fā)出連合纖維，經(jīng)過底板投射到對側(cè)脊髓。這一過程受到多種神經(jīng)導(dǎo)向因子的調(diào)控，如表達(dá)在脊索和底板的Netrin誘導(dǎo)表達(dá)其受體DCC的連合纖維的軸突朝向腹側(cè)中線的生長過程［3，4］。N-cadherin是一種重要的黏附分子，在雞胚發(fā)育過程中N-cadherin在脊髓中的表達(dá)具有典型的時(shí)空性變化，尤其在連合纖維的發(fā)育階段［5］。連環(huán)蛋白β-catenin是經(jīng)典Wnt通路的重要和關(guān)鍵分子，作為轉(zhuǎn)錄輔助因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。如它參與神經(jīng)系統(tǒng)的模式發(fā)生、神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化以及神經(jīng)元突起形成等方面。研究顯示胞內(nèi)β-catenin濃度的較高水平是維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖狀態(tài)的必要條件，在剔除β-catenin的基因突變鼠，大腦和脊髓的神經(jīng)組織體積下降，神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)量顯著減少［6-8］。對海馬等神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin水平還影響著神經(jīng)元突起的形態(tài)發(fā)生，高水平的β-catenin能促進(jìn)神經(jīng)元樹突的分支［9］。本實(shí)驗(yàn)借助雞胚活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)，下調(diào)N-cadherin和β-catenin的表達(dá)，分析其對脊髓神經(jīng)纖維投射的影響，為了解它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用提供證據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存; N-cadherin干擾載體(百奇生物科技有限公司合成)，干擾靶序列: GCAAATGAAGGTGAAGCTAAC，所用載體pGPU6-GFP-Neo; β-catenin干擾載體(百奇生物科技有限公司合成)，干擾靶序列: GCTTTAGGACTCCACCTTACA，所用載體pGPU6-GFP-Neo;一抗兔抗雞N-cadherin(Redies實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)) ;小鼠抗β-catenin單克隆抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司) ;二抗山羊抗兔Cy3標(biāo)記(中杉金橋生物技術(shù)有限公司) ;山羊抗小鼠Cy3標(biāo)記(中杉金橋生物技術(shù)有限公司) ; Dapi(Roche公司) ;質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司) ;受精雞蛋(本地種雞場) ; CUY-21型多功能活體電轉(zhuǎn)儀(日本NEPAGene公司) ; M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國Leica公司) ; Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本NIKON) ; CM1850冰凍切片機(jī)(德國Leica)。

1.2方法

1.2.1雞胚培養(yǎng)從種雞廠購買的新鮮受精雞蛋，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，用溫水洗凈、擦干，水平放入孵化箱。在溫度37.8℃，濕度65%，轉(zhuǎn)蛋間隔2 h的條件下孵育到第3天(stage 22)，用10 ml注射器針頭吸取3～4 ml蛋清，用眼科手術(shù)剪刀從上方針孔處將上面蛋殼剪開2～4 cm圓形開口，暴露卵黃和胚盤，進(jìn)行活體電轉(zhuǎn)基因操作。轉(zhuǎn)染后醫(yī)用膠布密封開口繼續(xù)培養(yǎng)到特定時(shí)間進(jìn)行觀察和取材。

1.2.2雞胚轉(zhuǎn)染2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA質(zhì)粒和0.5 μg/μl的pCAGGS-GFP質(zhì)?；旌弦?，2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-β-cateninshRNA質(zhì)粒與0.5 μg/μl pCAGGS-GFP質(zhì)粒混合液; 2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA質(zhì)

粒和2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-β-catenin-shRNA質(zhì)粒與0.5 μg/μl pCAGGS-GFP質(zhì)?；旌弦海约? μg/μl的pGU6-GFP-neo和0.5 μg/μl pCAGGS-GFP的對照質(zhì)粒，分別各取0.5～1 μl混合液用顯微注射毛細(xì)玻璃針在體視顯微鏡下注射到神經(jīng)管的中央管內(nèi);電極放在已注射質(zhì)粒的神經(jīng)管兩側(cè)，陽性電極在擬轉(zhuǎn)基因一側(cè)。電轉(zhuǎn)電壓18 V，電脈沖長度60 ms，間隔90 ms，電脈沖6次。電擊后用醫(yī)用膠布密封開口，整個(gè)過程在無菌操作工作臺(tái)內(nèi)完成;放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d，依次在倒置體視熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者視為陽性。

1.2.3取材與切片每組至少收集3個(gè)胚胎。取出整個(gè)胚胎，切下脊髓區(qū)域，置于4%多聚甲醛(PFA)中過夜;取出組織，吸干液體，轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液過夜;待沉淀到管底部時(shí)取出組織，用OCT包埋，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。切片時(shí)從－80℃冰箱取出已包埋的組織，在冷凍切片機(jī)上連續(xù)切片，切片分為10套;切片后置烤片機(jī)37℃烤片30 min以上，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4熒光免疫組織化學(xué)從－80℃低溫冰箱中取出的冷凍切片置40℃干燥20 min，4%PFA中4℃固定15 min，用1×TBS清洗3次，每次5 min，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5 min。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液孵育1 h。去除封閉液后每張載玻片加300 μl用封閉液稀釋的合適濃度的一抗:兔抗雞N-cadherin(1∶500)或鼠抗βcatenin(1∶100) 4℃孵育過夜。經(jīng)l×TBS清洗3次，每次5 min，每張片加300 μl用封閉液稀釋的用Cy3標(biāo)記的針對一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育4 h。經(jīng)DAPI襯染后封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Photoshop CS3軟件處理圖片，將3顏色同位拼合在一起，從而分析不同蛋白質(zhì)的表達(dá)定位;熒光強(qiáng)度平均光密度和面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析;數(shù)據(jù)處理采用SPSS Statistics17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1雞胚發(fā)育過程脊髓中敲減N-cadherin或βcatenin的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)中，采用shRNA干擾質(zhì)粒，借助雞胚活體原位電轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在雞胚脊髓中對N-Cadherin和β-catenin分別進(jìn)行干擾。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的一側(cè)(圖1B)，N-cadherin的表達(dá)相對于對側(cè)降低(圖1C)，說明N-cadherin的shRNA干擾載體能夠抑制N-cadherin在雞胚脊髓中的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染β-catenin干擾質(zhì)粒的脊髓切片中，同樣可以觀察到電轉(zhuǎn)側(cè)(圖1N)的β-catenin表達(dá)也受到抑制(圖1O)。在N-cadherin和β-catenin干擾質(zhì)粒共同干擾組中，電轉(zhuǎn)側(cè)的N-cadherin(圖1S)和β-catenin(圖1W)的表達(dá)同時(shí)發(fā)生下降。在對照組中，N-cadherin(圖1A')或β-catenin(圖1E')在電轉(zhuǎn)側(cè)的表達(dá)與對側(cè)沒有差別。為進(jìn)一步驗(yàn)證其干擾效果，對N-cadherin和β-catenin熒光免疫組化結(jié)果借助圖像分析軟件進(jìn)行分析，在分析過程中為了結(jié)果更具有可比性，充分利用雞胚脊髓的定時(shí)定位轉(zhuǎn)染優(yōu)勢，將脊髓橫切片從脊髓中央分為轉(zhuǎn)染測和對側(cè)未轉(zhuǎn)染側(cè)，在同一個(gè)采集視野范圍內(nèi)，統(tǒng)計(jì)平均光密度值，避免了由于組間拍照曝光時(shí)間長度的差異。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果從圖中(圖2)可以看出，轉(zhuǎn)染N-cadherin的shRNA干擾載體組中，轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin和βcatenin表達(dá)的平均光密度值極顯著(P＜0.01)地低于對側(cè)。在轉(zhuǎn)染β-catenin干擾載體組中，轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin的平均光密度與對側(cè)沒有太大差別，而βcatenin是低于對側(cè)的;在混合轉(zhuǎn)染組中轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin和β-catenin都有降低，但差異不顯著;對照組中轉(zhuǎn)染側(cè)和對側(cè)N-cadherin和β-catenin不存在明顯的差別，統(tǒng)計(jì)結(jié)果與圖片中觀察到的結(jié)果一致，從該統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖中能更直觀地看出其干擾的效果。

Note: The first column is nuclei staining with DAPI; the second column is the results of the report gene GFP expression; the third column C，K，S，A' is the results of N-cadherin (red) expression，and G，O，W，E' is the results of β-catenin (red) expression; the fourth column is the merge result.Scale bar is 200 μm in F' for all panels.

Note: * .show significant differences(P＜0.001) .

2.2下調(diào)N-cadherin或β-catenin的表達(dá)影響脊髓連合纖維的發(fā)育在抑制N-cadherin表達(dá)后，GFP標(biāo)記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)的投射明顯減少(圖1B、F)。在下調(diào)β-catenin表達(dá)的脊髓中，GFP標(biāo)記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)的投射也明顯減少(圖1J、N)。在同時(shí)下調(diào)N-cadherin和β-catenin的情況下，GFP標(biāo)記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)脊髓腹側(cè)白質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)顯著降低，但并沒有顯示出比前兩情形更嚴(yán)重(圖1R、V)。在對照組中，GFP標(biāo)記的神經(jīng)纖維在對側(cè)脊髓白質(zhì)內(nèi)大量分布(圖1Z、D')。為了更為直觀地對比連合纖維被抑制的結(jié)果，借助圖像分析軟件對脊髓橫切片GFP標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行了分析，從脊髓中央分隔，統(tǒng)計(jì)被轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達(dá)面積，然后統(tǒng)計(jì)對側(cè)投射連合纖維GFP表達(dá)面積，計(jì)算投射連合纖維GFP表達(dá)面積與被轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達(dá)面積的比值，投射纖維越多比值越大，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制柱形圖，從圖中(圖3)可以看到，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組中都極顯著(P＜0.01)低于對照組，而轉(zhuǎn)染組間差異不顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果與圖片中觀察到的現(xiàn)象統(tǒng)一。以上結(jié)果充分說明在抑制N-cadherin或β-catenin表達(dá)會(huì)影響連合纖維向脊髓對側(cè)的投射。

2.3 N-cadherin抑制表達(dá)對β-catenin表達(dá)的影響及其對神經(jīng)纖維投射影響作用的探討在抑制N-cadherin表達(dá)條件下，對β-catenin的表達(dá)進(jìn)行了染色。從結(jié)果可以看到，在N-cadherin抑制表達(dá)的一側(cè)脊髓，β-catenin的表達(dá)也明顯下降(圖1G)。相反，抑制β-catenin表達(dá)后N-cadherin的表達(dá)并沒有明顯的變化(圖1K)，說明N-cadherin調(diào)控β-catenin的表達(dá)，而β-catenin并不調(diào)控N-cadherin的表達(dá)。因此，下調(diào)N-cadherin抑制脊髓連合纖維的投射作用中很可能是通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖3　不同組GFP標(biāo)記脊髓橫切片對側(cè)投射纖維與轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達(dá)面積百分比Fig．3 Percentage of GFP expression in spinal cord slices from different groups of GFP labeled spinal cord slices

3　討論

在細(xì)胞內(nèi)β-catenin有兩個(gè)定位池:一個(gè)位于細(xì)胞膜，一個(gè)在細(xì)胞漿。β-catenin在細(xì)胞中有雙重作用:一是通過與細(xì)胞膜上cadherin相互作用，參與細(xì)胞間黏附。當(dāng)β-catenin表達(dá)上調(diào)時(shí)，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附作用，使細(xì)胞不容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。反之，βcatenin表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞間黏附作用被破壞，細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。另一作用是作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中最重要的信息分子，調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生物進(jìn)化中極為保守，從低等生物果蠅至高等哺乳動(dòng)物，其成員都具有高度的同源性，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化由細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白水平?jīng)Q定［10］。有研究表明β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與N-cadherin呈正相關(guān)［11］。在我們的實(shí)驗(yàn)中表明細(xì)胞內(nèi)βcatenin的表達(dá)受到N-cadherin的調(diào)控，但是N-cadherin的表達(dá)并不受β-catenin的調(diào)控，該研究結(jié)果與已報(bào)道的結(jié)果保持一致［11］。在前期實(shí)驗(yàn)中，課題組研究表明N-cadherin可能影響位于膜上的β-catenin，N-cadherin表達(dá)抑制后會(huì)導(dǎo)致膜上β-catenin向細(xì)胞核聚集［12］。而關(guān)于β-catenin在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究在腫瘤中的報(bào)道比較多［13，14］，在神經(jīng)纖維發(fā)育中作用的研究并不多。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過活體原位電轉(zhuǎn)基因技術(shù)和shRNA干擾技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在活體內(nèi)N-cadherin或β-catenin的抑制表達(dá)，觀察到在N-cadherin或β-catenin抑制表達(dá)的條件下都會(huì)影響到雞胚發(fā)育過程脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射。關(guān)于N-cadherin在神經(jīng)元以及神經(jīng)突起形成方面的研究早有報(bào)道［15］，但其機(jī)制并不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在抑制N-cadherin表達(dá)時(shí)β-catenin的表達(dá)下調(diào)，而在抑制β-catenin表達(dá)的條件下N-cadherin的表達(dá)并沒有變化，說明N-cadherin的表達(dá)正向調(diào)控β-catenin的表達(dá)。此外，抑制N-cadherin還是βcatenin的表達(dá)都會(huì)對脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射產(chǎn)生明顯的影響，但同時(shí)抑制兩者表達(dá)的表型與單獨(dú)抑制時(shí)類似。因此推測抑制N-cadherin表達(dá)影響脊髓連合纖維發(fā)育的作用很可能是通過β-catenin實(shí)現(xiàn)的?？紤]到N-cadherin和β-catenin組成的復(fù)合體在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用以及三種抑制表達(dá)的表型的相似性，N-cadherin和β-catenin很可能通過該方式參與脊髓連合纖維的發(fā)育過程。

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［收稿2015-04-17修回2015-07-07］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．013

作者簡介:楊慈清(1979年－)，男，博士，副教授，主要從事發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)研究，E-mail: yangciqing@ 126．com。

通訊作者③，E-mail: developmentlab@ 126．com。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1357-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)Q954.48