維生素D與細(xì)胞自噬的相關(guān)性及自噬相關(guān)基因PTEN的蛋白表達(dá)

劉 蓉 邱 齡* 武海燕 吳晨棟

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,山西 太原 030001)

維生素D與細(xì)胞自噬的相關(guān)性及自噬相關(guān)基因PTEN的蛋白表達(dá)

劉 蓉 邱 齡* 武海燕 吳晨棟

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,山西 太原 030001)

目的比較維生素D(VD)作用下的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生自噬的程度，以探索VD與自噬的關(guān)系，同時(shí)比較兩組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)因子PTEN的蛋白表達(dá)。方法將40只24個(gè)月老齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各20只，實(shí)驗(yàn)組大鼠每天經(jīng)灌胃給予最佳劑量的VD(預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳濃度3.704 μg/kg)，對(duì)照組正常飲食。6個(gè)月后，活體狀態(tài)下取1 mm3肝臟組織4 ℃保存，100 g肝組織-70 ℃凍存，用透射電鏡觀察各組肝臟細(xì)胞自噬泡的數(shù)量；用免疫組化檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)。結(jié)果電鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均出現(xiàn)典型自噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。與正常組相比，VD作用下的大鼠肝臟細(xì)胞自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值均明顯提高(P＜0.01)，免疫組化方法示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PTEN表達(dá)較正常組顯著升高(P＜0.01)。結(jié)論透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬方法證實(shí)VD可增強(qiáng)細(xì)胞發(fā)生自體吞噬，同時(shí)細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)量也相應(yīng)提高，推測(cè)VD引起自噬過(guò)程中可能與PTEN有關(guān)。

自體吞噬；VD；透射電鏡；免疫組化；PTEN

維生素D(VD)是一種脂溶性維生素，它的活性形式1，25-(OH)2VD3作為激素在人體不同的細(xì)胞控制不同的基因表達(dá)。有綜述提到VD可能是通過(guò)提高自噬從而延緩腫瘤等多種疾病病情，促進(jìn)人類健康[1]。自噬是真核細(xì)胞中一種重要的分解代謝過(guò)程，可以降解細(xì)胞中受損的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器，并可使之再循環(huán)成為細(xì)胞所需的能量及基本物質(zhì)[2]。最近有實(shí)驗(yàn)證明，自噬和大量的疾病有關(guān)，特別是腫瘤等疾病的發(fā)生可能都是由于自噬程度的降低[3-4]。自噬相關(guān)基因PTEN即磷酸酶與張力蛋白同源物是調(diào)節(jié)自噬體形成的關(guān)鍵因素[5]。過(guò)去都是在病理情況下研究VD與自噬的關(guān)系從而起到治療疾病的作用，那么在生理情況下VD是否一樣可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬而預(yù)防疾病。本實(shí)驗(yàn)中我們要觀察在老齡大鼠中VD是否可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬以及VD引起自噬的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是否有PTEN的參與，過(guò)去有研究表明提高自噬可以延緩衰老[6]。希望預(yù)期結(jié)果對(duì)衰老具體機(jī)制的研究及抗衰老策略的探索提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：40只24個(gè)月齡健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量320～470 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兩組均在普通光照環(huán)境下飼養(yǎng)，飼料為全價(jià)顆粒料(主要營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白19.31%、粗脂肪2.9%、粗纖維3.1%、水分8.7%、鈣0.5%、磷0.5%)，溫度20～24 ℃，濕度55%～80%，自然光照，飲用自來(lái)水，每周換墊料3次。普通飲食洗脫兩周后開(kāi)始對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行干預(yù)，即每天同一時(shí)間經(jīng)灌胃方式給予實(shí)驗(yàn)組大鼠的VD(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳VD濃度)。喂養(yǎng)6個(gè)月后，由于大鼠體質(zhì)量增加2倍，需先用乙醚麻醉，然后再用濃度為1%的戊巴比妥麻醉后暴露肝臟，快速剪下一小塊肝臟組織，在預(yù)冷的固定液內(nèi)于30 s將取下的組織切成1 mm3大小的組織塊，置于2%的戊二醛固定液2 h后緩沖液沖洗后浸泡，4 ℃保存標(biāo)本備用。切取100 g肝臟組織，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器：JEM-100CX II型透射電鏡(日本日立HITACHI公司H-600)，超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司 LKB-Ⅴ)。PTEN兔抗人多克隆抗體購(gòu)自博士德公司。

1.3 細(xì)胞自噬的檢測(cè)：透射電鏡觀察肝細(xì)胞自噬泡 經(jīng)過(guò)常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為50 nm)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡觀察、拍照、記錄。采用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算電鏡照片中各個(gè)細(xì)胞中自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比例，用SPSS 17.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)量

1.4.1 取材與切片準(zhǔn)備：動(dòng)物處死取材，分別取大鼠的腎臟組織置于10.0%甲醛中固定12 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片裱于涂有多聚賴氨酸的清潔玻片上，置80 ℃烤箱1 h，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 正常組 10×103萬(wàn)倍

圖2 VD組 10×103萬(wàn)倍

圖3 自噬泡 60×103萬(wàn)倍

圖4 正常組100倍

圖5 正常組400倍

圖6 VD組100倍

圖7 VD組400倍

1.4.2 主要試劑：小鼠抗人單克隆抗體pten為一抗，生物素化馬抗小鼠IgG為二抗，均購(gòu)自北京博士德公司；免疫組化試劑盒購(gòu)和顯色劑DAB均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4.3 步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，放置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐中高火4 min，低火8 min修復(fù)抗原滴加雙氧水溫浴10 min，用正常山羊血清封閉液孵育10 min中和非特異性抗原，再將切片滴加1∶50一抗溶液溫浴1 h，4 ℃過(guò)夜，最后，將切片依次用生物素標(biāo)記馬抗小鼠IgG和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育各30 min，DAB染色2 min切片中PTEN表達(dá)蛋白陽(yáng)性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。

1.5 圖像分析：將免疫組化切片經(jīng)數(shù)碼顯微攝像后輸入計(jì)算機(jī)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)的平均光密度值，光密度與染色強(qiáng)弱呈正比，用SPSS 17.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察：透射電鏡下正常組肝臟細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯；肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴較多，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，自噬溶酶體少見(jiàn)(圖1)，作用VD的實(shí)驗(yàn)組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度邊集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，線粒體輕度腫脹，體積增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，自噬溶酶體最多(圖2)自噬泡為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞質(zhì)成分或廢棄的細(xì)胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.2 自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值：經(jīng)Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞電鏡照片中自噬泡占胞質(zhì)總面積的比例結(jié)果顯示：VD作用下的實(shí)驗(yàn)組(0.0487±0.0044)均較正常組(0.0091±0.0025)明顯增加(表1)。

表1 各組細(xì)胞中自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值(,n=18)

表1 各組細(xì)胞中自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值(,n=18)

注:與正常組比較,*P＜0.01

組別 正常組 VD組比值 0.0091±0.0025 0.0487±0.0044*

2.3 免疫組化染色結(jié)果：pten在兩組腎臟中均有表達(dá)(圖4～7)，但兩組間的PTEN蛋白表達(dá)均有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VD作用下的實(shí)驗(yàn)組(0.406±0.098)均較正常組(0.0168±0.078)明顯增加(表2)。

表2 正常飲食組與VD組PTEN的表達(dá)(光密度值 ,n=18)

3 討 論

在過(guò)去100年中，國(guó)內(nèi)外對(duì)VD在鈣磷代謝方面的研究已經(jīng)很透徹。因?yàn)閂D可以經(jīng)紫外線照射在體內(nèi)生物合成，所以有人提到人們可以通過(guò)每天長(zhǎng)時(shí)間日曬來(lái)增加體內(nèi)的VD水平，但發(fā)現(xiàn)紫外線損傷皮膚并增加皮膚癌，由此開(kāi)始質(zhì)疑VD的作用。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)樽贤饩€中的長(zhǎng)波可以破壞人體血液中的維生素D，短波紫外線對(duì)人體的傷害很大，短時(shí)間照射即可灼傷皮膚，長(zhǎng)期或高強(qiáng)度照射還會(huì)造成皮膚癌，只有中波能促進(jìn)體內(nèi)礦物質(zhì)代謝和維生素D的形成，從中我們得到對(duì)皮膚的損害與短波紫外線有關(guān)，與產(chǎn)生VD的中波紫外線無(wú)關(guān)。所以我們可以通過(guò)服用VD增加體內(nèi)VD水平從而彌補(bǔ)了長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度日曬破壞皮膚的不足。最近10年，通過(guò)細(xì)胞、分子生物及基因等多方面更精細(xì)的研究發(fā)現(xiàn)VD的活性形式1，25-(OH)2VD3作為一種多效型激素在人體許多不同的細(xì)胞中調(diào)控著將近900多種不同的基因表達(dá)并調(diào)控它們的增殖、分化與存活，它對(duì)人類健康的作用開(kāi)始漸漸浮現(xiàn)。許多流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明1，25-(OH)2VD3及其類似物除能治療與鈣有關(guān)的預(yù)防或治療疾病(如佝僂病，軟骨病，骨質(zhì)疏松癥和甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥)外，也延緩許多其他疾病包括牛皮癬，以及某些類型的癌癥傳染病(如肺結(jié)核，慢性肝炎)，心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7-11]。Mathiasen等第1次通過(guò)VD及其類似物EB108對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制增殖和分化作用的研究推測(cè)在腫瘤細(xì)胞中VD可以通過(guò)提高自噬而延緩病情[12]。Ordonez-Moran等在研究VD和腫瘤關(guān)系中推測(cè)二者之間可能與自噬有關(guān)[13]。對(duì)于VD和結(jié)核病的研究已有很久的歷史，但Yuk等在2009年第1次證實(shí)1，25-(OH)2VD3是通過(guò)自噬而治療結(jié)核病，而并非人們?cè)仍O(shè)想的是通過(guò)鈣化結(jié)核灶而治療結(jié)核病。此外，生理?xiàng)l件下相關(guān)濃度的1，25-(OH)2VD3誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的自噬現(xiàn)象表明自噬現(xiàn)象并不局限于腫瘤，可能在生理?xiàng)l件下誘導(dǎo)自噬[14]。

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過(guò)程中都存在的一個(gè)凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制[15]。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定，這一過(guò)程在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。目前許多學(xué)者提出飲食限制延緩衰老的效果可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。國(guó)內(nèi)并有實(shí)驗(yàn)證明自噬確實(shí)可以延緩衰老。

PTEN是至今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3，全長(zhǎng)200 kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，編碼403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。PTEN可通過(guò)促進(jìn)自噬體的形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[16]。它是自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的相關(guān)基因，是自噬的正向調(diào)節(jié)分子，它可以以通過(guò)催化PIP3向PIP2的轉(zhuǎn)化來(lái)抑制AKT的活性，從而解除classIPIK3/PKB途徑對(duì)自噬的抑制[17]。最近有實(shí)驗(yàn)證明有些藥物在影響細(xì)胞自噬過(guò)程中，可以影響到PTEN的蛋白表達(dá)[18]。

基于以上研究，在腫瘤、肺結(jié)核等疾病中，VD均是通過(guò)自噬而延緩及治療疾病的。明確過(guò)去的研究資料主要是在病理狀態(tài)，那么對(duì)于正常的老年人群，適當(dāng)劑量的VD是否一樣可以在生理?xiàng)l件下通過(guò)細(xì)胞自噬而延緩衰老，目前并沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，通過(guò)給予實(shí)驗(yàn)組老齡大鼠最佳劑量的VD，對(duì)照組正常飲食，6個(gè)月后，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的自噬程度及PTEN的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)服用VD組大鼠較正常組相比肝臟細(xì)胞發(fā)生自體吞噬的程度明顯增強(qiáng)，PTEN蛋白表達(dá)也明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明VD可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能是通過(guò)PTEN參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。這為VD的延緩衰老的效果和細(xì)胞自噬的具體機(jī)制提供了有關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為以后延緩衰老及預(yù)防衰老相關(guān)疾病的發(fā)生有著重要的意義。

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Effect of Vitamin D on Autophagy and Expression of PTEN

LIU Rong, QIU Ling, WU Hai-yan, WU Chen-dong
(Department of Cardiology, Second Hospitul of Shanxi Medical University ,Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo probe into the relationship between vitamin D(VD)and autophagy by comparing two groups which are VD group and normal diet group of older rats liver’s autophagy level, meanwhile compare the expressions of the autophagy-related factor PTEN of kidney between the two groups.Methods24-month-aged rats were randomly grouped into two groups -control group(normal dieting), experimental group(the appropriate VD by gavaging)with 20 rats in each group. After six months, get liver tissues by autopsy, then make 1 mm3liver stored at 4 ℃ meanwhile 100 g liver tissues at -70 ℃. To detect the amount of autophagic vacuoles in liver cell by TEM(transmission electron microscope); using immunohistochemical staining method to detect the expression of PTEN.ResultsTypical morphological changes of autophagy can be seen in cell. Compared with control group, the ratio of the amount of autophagic vacuoles to that of total cytoplasm in experimental group increased significantly(P＜0.01), PTEN in experimental group increased significantly(P＜0.01).ConclusionThe detection methods prove that VD can enhance the probability of autophagy in cells, Meanwhile the result that PTEN expression varied with the extension of autophagy, indicate that the autophagy induced by VD maybe related to PTEN.

Autophagy; VD; Transmission electron microscopy; Immunohistochemical; PTEN

R363

B

1671-8194（2015）05-0001-03

山西省自然基金資助項(xiàng)目(2010011054-2)

*通訊作者