中國(guó)乳菇屬一新記錄種的形態(tài)學(xué)及分子鑒定*

田慧敏，劉鐵志，畢曉丹

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

〈資源開(kāi)發(fā)〉

中國(guó)乳菇屬一新記錄種的形態(tài)學(xué)及分子鑒定*

田慧敏，劉鐵志，畢曉丹

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

采用形態(tài)描述及分子鑒定采自中國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)的群生標(biāo)本，確定為中國(guó)乳菇屬一新記錄種（Lactarius scoticus）。主要鑒別特征是菌蓋直徑3.6 cm～6 cm，半球形，中部稍下凹，白色或污白色，表面光滑，中間色深，赭黃色或金黃色，邊緣內(nèi)卷并有絨毛；菌肉白色，受傷后變淡黃色，厚，具有輕微辣味，乳汁白色，不變色。菌褶白色、密、延生。菌柄白色，孢子無(wú)色，橢圓形，有小刺，大?。?～7.2）μm×（4.8～7.0） μm；擔(dān)子棒狀，（28.8～38.4） μm×（7.2～9.6） μm；褶側(cè)囊狀體近梭形，（28.8～53.2） μm×（6.7～8.4）μm；褶緣囊體與側(cè)囊體形狀相似。菌蓋表皮由雜亂的菌絲組成，有豐富的乳管，菌絲無(wú)色有隔膜，直徑4.3 μm～7.2 μm，菌蓋表皮具囊狀體，棒狀，有隔膜，（48～67.2）μm×（12～14.4）μm。經(jīng)分子鑒定，標(biāo)本與Lactarius scoticus聚在一枝，屬于乳菇屬（Lactarius）辣乳菇亞屬（Piperates）Aspideini組，支持率為76%。

乳菇屬；中國(guó)新記錄種；分子鑒定

乳菇屬（Lactarius）屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycotina）傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）。主要特點(diǎn)是子實(shí)體肉質(zhì)，菌蓋下凹，常具臍狀，同心環(huán)紋有或無(wú)，色澤多樣，表面光滑，被短毛至被長(zhǎng)毛。菌褶延生，菌肉具有大量的球狀細(xì)胞和產(chǎn)乳系統(tǒng)；孢子在顯微鏡下無(wú)色至淡黃色，通常球形至寬橢圓形，具有小疣或小刺，常具有囊狀體[1]。乳菇屬生長(zhǎng)在林中地上，通常與高等植物形成菌根，在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用，分布廣泛。在實(shí)際鑒定中僅用傳統(tǒng)分類(lèi)法，經(jīng)常出現(xiàn)錯(cuò)誤或產(chǎn)生爭(zhēng)議。因此許多菌物學(xué)鑒定時(shí)常輔以分子手段。

ITS是rDNA中的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，該區(qū)保守性強(qiáng)，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出較高的序列多態(tài)性。國(guó)內(nèi)外許多菌物學(xué)家利用rDNA-ITS全序列測(cè)序?qū)θ楣綄傧碌姆N類(lèi)進(jìn)行鑒定，如松乳菇（Lactarius deliciosus）[2-4]、橙紅乳菇（L.akahatsu） 以及紅汁乳菇（L.hatsudake）[5]等。本文對(duì)采自內(nèi)蒙古的一個(gè)乳菇屬新記錄種進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1 材料與方法

1.1供試標(biāo)本

供試標(biāo)本子實(shí)體10069于2013年8月間采自賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，標(biāo)本晾干后，編號(hào)、分類(lèi)、鑒定，超低溫冷凍后存于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（CFSZ）。

1.2形態(tài)鑒定

鑒定方法采用宏觀特征、顯微結(jié)構(gòu)與化學(xué)試劑反應(yīng)相結(jié)合的方法。宏觀觀察使用體式顯微鏡，顏色的判斷主要依據(jù)采集時(shí)拍攝的彩色照片，大小用游標(biāo)卡尺測(cè)量新鮮子實(shí)體2個(gè)～5個(gè)，顯微觀察通常4%～5%KOH作浮載劑。測(cè)量孢子30個(gè)，菌絲、囊狀體、擔(dān)子各15個(gè)。

1.3ITS鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法：子實(shí)體干品菌蓋部分（含菌褶）用液氮研磨，提取基因組DNA[2]，并使用北京鼎國(guó)公司的DNA純化試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。

1.3.2 rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序

ITS-PCR的擴(kuò)增體系為：PCR colorless mix 25 μL，20 μmol·L-1ITS1/ITS4引物（TCCGTAGGTG AAC CTGCGC/TCCTCCGCTTATTGATATGC）各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在德國(guó)Eppendorf公司的5331型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性3 min，95℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平5 min，終止溫度為4℃。PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物科技有限公司完成測(cè)序。

1.3.3 ITS序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

將已測(cè)得的ITS序列，轉(zhuǎn)換為FASTA格式，用MEGA5.1軟件Alignment程序，對(duì)其與從GenBank中通過(guò)BLAST檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對(duì)位排比，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Kimura2-parameter模式計(jì)算遺傳距離，采用鄰位相連法進(jìn)行進(jìn)化距離分析。

2 結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)特征描述

Lactarius scoticusBerk.&Broome，菌蓋直徑3.6 cm～6 cm，半球形，中部稍下凹，白色或污白色，表面光滑，中間色深，赭黃色或金黃色，邊緣內(nèi)卷并有絨毛；菌肉白色，受傷變淡黃色，厚，具有輕微辣味，近柄處厚2 mm～4 mm，乳汁白色，不變色。菌褶白色、密、延生，等長(zhǎng)。菌柄白色，圓柱形，長(zhǎng)2.0 cm～2.4 cm，粗0.6 cm～0.9 cm，實(shí)心；孢子無(wú)色，橢圓形，有小刺，大?。?～7.2）μm×（4.8～7.0）μm；擔(dān)子棒狀，無(wú)色，具4個(gè)小梗，（28.8～38.4）μm×（7.2～9.6）μm；褶側(cè)囊狀體無(wú)色，有金黃色內(nèi)含物，近梭形，（28.8～53.2） μm×（6.7～8.4） μm；褶緣囊體與側(cè)囊體形狀相似。菌蓋表皮由雜亂的菌絲組成，有豐富的乳管，菌絲無(wú)色有隔膜，有的頂端膨大，直徑4.3 μm～6.2 μm，菌蓋囊狀體頭狀，有隔膜，（48～67.2） μm×（12～14.4） μm。菌柄表皮由泡囊細(xì)胞和菌絲組成，細(xì)胞 （16.8～50） μm×（14.4～50）μm。

鑒定標(biāo)本來(lái)自內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)東溝白樺林地上，群生，田慧敏、劉鐵志等于2013年8月14日采集。

圖1 乳菇屬標(biāo)本10069外形特征及顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphology and microstructure of Lactarius sp.10069

2.2rDNA-ITS的鑒定

PCR擴(kuò)增的樣品子實(shí)體DNA的ITS序列，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定標(biāo)本10069ITS片段長(zhǎng)度約為710 bp，與測(cè)序結(jié)果相符。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

鑒定標(biāo)本10069 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 鑒定標(biāo)本10069及來(lái)自Genbank的最相似物種的ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 NJ phylogenetic tree of ITS for Lactarius sp.10069 and the similar speices from Genbank

分析結(jié)果表明，12個(gè)種序列聚為兩大類(lèi)，即紅菇屬（Russula）和乳菇屬（Lactarius），乳菇屬又明顯分為乳菇亞屬（Lactarius）和辣乳菇亞屬（Piperates）。前者屬下有Lactarius salmonicolor和Lactarius sanguifluus。辣乳菇亞屬又分為Aspideini組和Piperates組。前者組下有Lactarius pubescens、Lactarius scoticus和Lactarius tesquorum三個(gè)種。而Piperates組下僅有Lactarius zonariodess一種。乳菇屬標(biāo)本10069與Lactarius scoticus聚在一枝，屬于辣乳菇亞屬（Piperates）Aspideini組，支持率為76%。

3 討論

本研究中，乳菇屬標(biāo)本10069分子數(shù)據(jù)顯示與Lactariuspubescens、Lactariusscoticus、Lactarius tesquorum親緣關(guān)系較近。但是Lactarius tesquorum孢子大小為（7～9）μm×（5～7）μm，明顯大于乳菇屬標(biāo)本10069；而絨邊乳菇（Lactarius pubescens）子實(shí)體及囊狀體遠(yuǎn)大于乳菇屬標(biāo)本10069，分別為5 cm～10 cm、（50～60）μm×（8～10） μm，且絨邊乳菇（Lactarius pubescens）和Lactarius tesquorum菌蓋多為淺土黃色、乳白色，表面具長(zhǎng)絨毛，邊緣具纖維質(zhì)粗毛，外形差異較大[6-8]。而供試標(biāo)本10069的菌蓋1.4 cm～6 cm，基本都為白色或灰白色，表面無(wú)絨毛，但具有似毛狀紋理，邊緣常常具長(zhǎng)毛，1 mm～2 mm，菌蓋中央為金黃色或赭黃色，這是該標(biāo)本顯著特征。孢子（5.5～7.5） μm×（5～6） μm，擔(dān)子（30～45） μm×（7～9） μm[7]。鑒定標(biāo)本與Lactarius scoticus完全相符合。

Lactarius scoticusBerk.&Broome于1879年首次在歐洲蘇格蘭高地被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)在德國(guó)、英國(guó)、法國(guó)均有分布。由于與絨邊乳菇親緣關(guān)系較近，1991年Krieglst修訂命名為L(zhǎng)actarius pubescensvar.scoticus(Berk.&Broome)Krieglst[9]，而作者認(rèn)為該種與絨邊乳菇Lactarius pubescens差異較大，仍沿用Lactarius scoticusBerk.。該種主要分布于歐洲，在中國(guó)未見(jiàn)記錄。

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Mocular Identification and Morphology of Lactarius sp.,a New Record of China

TIAN Hui-min,LIU Tie-zhi,BI Xiao-dan
(College of Life Science,Chifeng University,Chifeng 024000,China)

A newly recorded specie ofLactarius(Lactarius scoticus)from China was described in this paper,and the specimen were collected from Saihanwula Reserve of Chifeng city,Inner Mongolia,China.The main distinguishing feature is as follows: the cap is hemispherical,central slightly concave,white or dirty white with ocher yellow or golden yellow in the centre,surface smooth,and the flush is white and becomes yellow when injury,and tastes spicy.The milk is white and no discoloration.Gills are white,dense,and spores are colorless,oval-shaped,with small spines,(6-7.2)μm×(4.8-7.0)μm.Basidia are clavate，(28.8-38.4)μm×(7.2-9.6)μm.Pleurocystides are fusiform,(28.8-53.2)μm×(6.7-8.4)μm.Cheilocystides are similar to Pleurocystides.Epidermal mycelium of cap is composed by messy mycelium,4.3 μm-7.2 μm,with rich milk ducts,Pileipellis septum [(48-67.2)μm×(12-14.4)μm].The specimen gathered withLactarius scoticusat a branch by the molecular identification.It was belonging to the genusLactariuswith support rate 76%.

Lactarius;a new record of China;classification and description

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0013-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.003

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012MS0501）；內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY12309）。

田慧敏（1980-），女，碩士，講師，主要從事菌物多樣性研究。E-mail:tiancfxy2009@126.com

2015-04-28