3種酸堿環(huán)境模擬方法的比較

劉龍昌　司衛(wèi)杰　周紅麗　王菲　陳然　周正軍

摘要：比較研究NaOH/HCl法、磷酸緩沖液法和綜合法不同酸堿環(huán)境模擬方法對(duì)確定適宜的方法具有重要意義。以白菜（Brassica rapa var. chinensis）為試驗(yàn)材料，研究NaOH/HCl法、磷酸緩沖液法和綜合法對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，不同模擬方法的萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)在所有pH值條件下均有極顯著差異（P

關(guān)鍵詞：pH值；酸堿環(huán)境；模擬方法；萌發(fā)指數(shù)；活力指數(shù)；根長(zhǎng)；苗長(zhǎng)；白菜

中圖分類號(hào)： O655.22 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0426-06

在植物的生活史中，種子萌發(fā)和幼苗階段是植物對(duì)環(huán)境脅迫忍耐力最小的階段[1]。除了種子自身的健康狀況、休眠等內(nèi)部因素以外，種子能否順利萌發(fā)出苗，還受到外界環(huán)境因子如溫度、光照、pH值、土壤水分和鹽分等的影響[2-3]，pH值是影響土壤養(yǎng)分形態(tài)和有效性的主要因素之一[4]。大多數(shù)植物適合在中性土壤中生長(zhǎng)，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[5]，也可能會(huì)使植物所需營(yíng)養(yǎng)元素的生物有效性發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致植株某些營(yíng)養(yǎng)元素失調(diào)[6]。pH值也可通過(guò)影響種子的蛋白水解酶活性或膜勢(shì)能影響種子的萌發(fā)[7-8]。

在研究 pH 值對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)，不同研究者往往采用不同的方法模擬土壤的酸堿環(huán)境，目前涉及的模擬方法多達(dá)近10種[9-12]。按化合物種類和作用原理的不同，可將其可分為三大類：強(qiáng)酸堿法[13]、磷酸緩沖液法[3，14]、綜合法，即不同 pH 值區(qū)段采用不同的緩沖溶液[2，15]。因所采用的化合物種類不同，上述各種模擬溶液中的離子類型和離子強(qiáng)度就會(huì)明顯不同，不同模擬方法pH值的穩(wěn)定性也會(huì)有一定差異。因此，從理論上來(lái)說(shuō)，采用不同方法模擬的研究結(jié)果可能會(huì)有很大差異。但是，目前尚缺乏這方面的實(shí)證性研究報(bào)道。因此，本研究以白菜（Brassica rapa var. chinensis）為試驗(yàn)材料，對(duì)比研究3種常用方法的模擬效果，以期為確定適宜的模擬方法提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇對(duì)酸堿脅迫比較敏感的白菜為研究材料，挑選成熟度好且健康飽滿的種子作試材。種子活力的測(cè)定采用氯化三苯四氮唑（TTC）法，經(jīng)測(cè)定種子活力達(dá)95%以上。

1.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

用pH值分別為4、5、6、7、8 、9、10等7 個(gè)水平的模擬酸堿溶液為培養(yǎng)液，以蒸餾水為對(duì)照，進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。各處理培養(yǎng)皿中初次加入約7 mL培養(yǎng)液浸濕濾紙，以后每天加入1～3 mL相同pH值的培養(yǎng)液以保持濾紙濕潤(rùn)。在試驗(yàn)過(guò)程中，每2 d更換1次濾紙，補(bǔ)充相同pH值培養(yǎng)液，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)pH值恒定。將培養(yǎng)皿置于人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光暗周期12 h/12 h，光照度 250 μmol/（m2·s），溫度25 ℃，每個(gè)處理水平均設(shè)4個(gè)重復(fù)。

采用2種種子預(yù)處理方法：（1）蒸餾水浸種處理。將白菜種子用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，自來(lái)水沖洗5 min后用蒸餾水浸泡3 h，然后濾干種子。（2）培養(yǎng)液浸種處理。用各培養(yǎng)液浸泡3 h，其他處理同上。

1.3 3種酸堿模擬溶液的配制方法 （1）NaOH/HCl法。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將蒸餾水調(diào)配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10的溶液[16]。（2）磷酸緩沖液法。用0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10的緩沖液[3，14]。（3）綜合法。用2 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀與1 mol/L HCl配制成pH值為4的緩沖液；用2 mmol/L 2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）與 1 mol/L NaOH 配制pH值分別為5、6的緩沖液，用2 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 與1 mol/L NaOH 配制pH值分別為7、8的緩沖液，用2 mol/L N-三（羥甲基）甲基甘氨酸與1 mol/L NaOH配制pH值為9、10的緩沖液[2]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)芽試驗(yàn)以胚根露出種皮 2 mm 作為萌發(fā)的標(biāo)志，每 12 h 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，連續(xù)12 h無(wú)種子發(fā)芽即結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn)，并于試驗(yàn)后72 h測(cè)定根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)。計(jì)算萌發(fā)率Gr、萌發(fā)指數(shù)Gi和活力指數(shù)Vi。其中：萌發(fā)率Gr=發(fā)芽種子數(shù)/試驗(yàn)種子數(shù)×100；萌發(fā)指數(shù)Gi=∑Gt/Dt（Gt為第t天時(shí)的萌發(fā)數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)時(shí)間；活力指數(shù)Vi=S×∑Gt×Dt（S為幼苗的平均長(zhǎng)度=根長(zhǎng)+苗長(zhǎng)）[11]。其中，萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)為萌發(fā)參數(shù)；苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)和活力指數(shù)為生長(zhǎng)參數(shù)。

對(duì)種子萌發(fā)率等數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、單因素方差（One Way ANOVA）分析和多重比較（LSD），用Excel 2003作圖，研究結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種酸堿環(huán)境模擬方法對(duì)種子萌發(fā)的影響

表1顯示，蒸餾水浸種時(shí)，不同模擬方法的萌發(fā)率雖有一定差異，但未呈現(xiàn)規(guī)律性變化，pH值為5、8、10時(shí)差異顯著，其他pH條件下差異不顯著；此時(shí)，所有pH值條件下的萌發(fā)指數(shù)均差異極顯著；處理液浸種時(shí)，所有pH值條件（除了pH值為6的以外）下，不同模擬方法的2 個(gè)萌發(fā)參數(shù)差異顯著或極顯著，且這種差異主要存在磷酸緩沖液法與其他2種方法之間。用處理液浸種時(shí)，這種差異更大一些，2種浸種方法預(yù)處理后的試驗(yàn)結(jié)果相似，都是磷酸緩沖液法的最低。采用NaOH/HCl法時(shí)，pH值在4～10的條件下，2種浸種方法的萌發(fā)率均差異不顯著，但處理液浸種的萌發(fā)指數(shù)顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。蒸餾水浸種時(shí)，僅pH值為10的萌發(fā)率與對(duì)照差異顯著（P<0.05），其他pH值條件下差異均不顯著；pH值為5～7的萌發(fā)指數(shù)與pH值為9～10的差異顯著，其他pH值條件下差異均不顯著；用處理液浸種時(shí)，pH值為6的萌發(fā)率與對(duì)照十分接近，它們與pH值為5、7～9的萌發(fā)率差異不顯著，與pH值為4、10的差異顯著（Pendprint

從3種模擬方法的種子萌發(fā)進(jìn)程（圖1、圖2）可知，磷酸緩沖液法的種子萌發(fā)率最低，萌發(fā)速度最慢。

2.2 3種酸堿環(huán)境模擬溶液對(duì)白菜種子活力指數(shù)及苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)的影響

表2顯示，pH值在4～10之間時(shí)，不同模擬方法的3 個(gè)生長(zhǎng)參數(shù)差異均極顯著，且這種差異主要存在于磷酸緩沖液法與其他2種方法之間。2種浸種法預(yù)處理后的試驗(yàn)結(jié)果也比較一致，都是磷酸緩沖液法最低。采用NaOH/HCl法時(shí)，2種浸種方法的苗長(zhǎng)（pH值為4～10）、pH值為6～7的根長(zhǎng)、pH值為6～8的活力指數(shù)差異均不顯著，其他pH值條件下的處理液浸種的活力指數(shù)和根長(zhǎng)均顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。采用蒸餾水浸種時(shí)，pH值為5的活力指數(shù)與對(duì)照差異顯著，其他pH值條件下差異均不顯著，所有pH值條件下的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)與對(duì)照差異均不顯著。采用處理液浸種時(shí)，pH值為6～7的活力指數(shù)與對(duì)照差異不顯著，其他pH值條件下與對(duì)照差異顯著或極顯著；pH值為6～7的根長(zhǎng)與對(duì)照差異顯著，其他pH值條件下與對(duì)照差異極顯著；pH值為4～10的苗長(zhǎng)與對(duì)照差異均不顯著。采用磷酸緩沖液法時(shí)，pH值在 4～10 的條件下，2種浸種方法的苗長(zhǎng)差異均不顯著；除中性（pH值為7）條件下的根長(zhǎng)差異不顯著外， 其他pH值條件下的根長(zhǎng)和活力指數(shù)均差異顯著，且均是處理液浸種的低于蒸餾水浸種的。同時(shí)，2種浸種方法的上述3個(gè)生長(zhǎng)參數(shù)在所有pH值條件下均極顯著低于對(duì)照。采用綜合法時(shí)，2種浸種方法的苗長(zhǎng)（pH值為4～9）、根長(zhǎng)（pH值為6～7）、活力指數(shù)（pH值為5～7）差異均不顯著，其他pH值條件下的處理液浸種的活力指數(shù)和根長(zhǎng)均顯著或極顯著低于蒸餾水浸種。采用蒸餾水浸種時(shí)，pH值為5～7的活力指數(shù)和根長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著，其他pH條件下均差異顯著或極顯著；在pH值為 4～10 的條件下，苗長(zhǎng)與對(duì)照差異均不顯著。采用處理液浸種時(shí)，pH值為6的活力指數(shù)和根長(zhǎng)與對(duì)照差異均不顯著，其他pH值條件下差異顯著或極顯著；pH值為4～8時(shí)的苗長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著，僅pH值為9～10時(shí)差異極顯著。

上述研究結(jié)果表明，磷酸緩沖液不僅對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制作用顯著，而且對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用也顯著，因而不宜作為酸堿環(huán)境的模擬方法。同時(shí)，綜合種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)2個(gè)階段的研究結(jié)果不難看出，綜合法模擬的結(jié)果更接近白菜種子對(duì)酸堿環(huán)境的適應(yīng)情況。

3 結(jié)論與討論

土壤pH值是影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子[17]，不同植物有不同的pH值適應(yīng)范圍。中性和偏酸性的環(huán)境有利于白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，堿性和強(qiáng)酸性環(huán)境有顯著抑制作用[18-19]。在本研究中，3種模擬方法在偏酸性和中性條件下的5 個(gè)參數(shù)值均最大（表1、表2）。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，中性和偏酸性的環(huán)境有利于白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。

在強(qiáng)酸性或堿性條件下，NaOH/HCl法的各參數(shù)值仍然維持很高的水平，尤其在蒸餾水浸種時(shí)。而此時(shí)，綜合法的各參數(shù)值卻顯著低于對(duì)照。在pH值為4～10的條件下，磷酸緩沖液法的各參數(shù)均遠(yuǎn)低于對(duì)照，且在大多數(shù)情況下，萌發(fā)的幼苗多為畸形苗或黃化苗。這表明磷酸緩沖液對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有明顯的抑制和毒害作用，是最不適宜的模擬方法。綜合法更接近白菜種子對(duì)酸堿環(huán)境的實(shí)際適應(yīng)情況，是最佳方法。

因種子萌發(fā)所需的物質(zhì)和能量主要依靠自身貯存的營(yíng)養(yǎng)提供，加之有種皮的保護(hù)，所以相對(duì)于幼苗階段，種子萌發(fā)階段受不良環(huán)境的影響會(huì)小一些[13，20]。萌芽速度快的種子受到的影響會(huì)更小，尤其在吸足水分后。因?yàn)樵诓涣辑h(huán)境產(chǎn)生的脅迫作用顯現(xiàn)之前，種子已經(jīng)完成了萌發(fā)過(guò)程。這應(yīng)該是白菜種子萌發(fā)率在所有pH值條件下均很高的主要原因（磷酸緩沖液法除外），這種萌發(fā)情況顯然與白菜的實(shí)際狀況不相符。另外，在野外條件下，種子一開始就處于相應(yīng)的酸堿環(huán)境中。因此，采用處理液浸種才能更好地反映種子對(duì)酸堿環(huán)境的實(shí)際適應(yīng)能力。

采用NaOH/HCl和Na2HPO4/NaH2PO4等離子化合物模擬酸堿環(huán)境時(shí)，不僅pH值會(huì)對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，而且這些化合物還可通過(guò)滲透效應(yīng)和離子效應(yīng)對(duì)種子產(chǎn)生鹽脅迫[21-22]。有的研究表明，在鹽迫害中起主要抑制作用的是滲透脅迫[23]；有的研究表明，起主要作用的是離子效應(yīng)，尤其是Na+毒害作用[24]。過(guò)多的Na+會(huì)使相關(guān)代謝酶失活而對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用[25-26]。一定濃度的磷酸根也會(huì)對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用[27]。在本研究中，NaOH和HCl的濃度為1 mol/L，而Na2HPO4和NaH2PO4濃度僅為0.2 mol/L。前者的離子濃度雖遠(yuǎn)高于后者，但是在所有pH值條件下，后者對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用都遠(yuǎn)大于前者。由此可知，離子效應(yīng)（尤其是磷酸根的存在）應(yīng)該是白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制的主要原因。采用綜合法時(shí)，因各pH值區(qū)段使用的化合物濃度僅為2 mmol/L，并且各區(qū)段化合物均處于其最適緩沖范圍內(nèi)，所以調(diào)節(jié)pH值時(shí)使用的NaOH和HCl量也很小，加之使用的又多是非離子化合物（如HEPES）。因此，該方法的離子濃度遠(yuǎn)低于前2種方法，因大量離子的存在而引起的滲透效應(yīng)和離子毒害也必然會(huì)小很多，這也應(yīng)該是該方法模擬效果最好的主要原因。

在探討pH值對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)，須要提供穩(wěn)定的pH值環(huán)境。不同模擬方法的pH值穩(wěn)定性往往不同，由于有同離子效應(yīng)，緩沖液法的穩(wěn)定性好于NaOH/HCl法。又由于綜合法在不同pH值區(qū)段采用了處于最適緩沖范圍的緩沖液，所以其pH值的穩(wěn)定性（即緩沖效果）應(yīng)該是最好的。無(wú)論是在處理液配制過(guò)程中，還是在種子萌發(fā)的過(guò)程中，NaOH/HCl溶液都容易發(fā)生pH值的躍變，這必然會(huì)影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，這也應(yīng)該是該方法模擬效果不佳的主要原因之一。

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