小白鼠6種組織部位總DNA不同提取方法的比較

張雨欣　高秋　逄洪波　趙佳欣　秦源源　姚麗梅　魏繼瑩

摘要：為了得到經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易于操作且效果好的基因組DNA，選取小白鼠6種不同的組織部位：肝、脾、腎、尾、肺和心臟，分別采用SDS法和CTAB法提取基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)和PCR3種手段對(duì)其質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：小白鼠6種組織部位采用SDS和CTAB法提取的基因組DNA均可擴(kuò)增得到目的基因，滿足下一步分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求。但是從DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量方面，不同組織部位之間具有很大差別，CTAB法和SDS法針對(duì)不同的組織部位具有不同的優(yōu)勢(shì)。總體來(lái)看，在小鼠的6種組織部位中，肝臟最適合用來(lái)提取基因組DNA。

關(guān)鍵詞：SDS法；CTAB法；基因組DNA；DNA提?。恍“资?；組織器官

中圖分類號(hào)： Q523 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0047-03

DNA是生物體的基本遺傳物質(zhì)?；蚪MDNA的提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)試驗(yàn)操作[1]，其提取效率和質(zhì)量的好壞直接決定了后面一系列基因工程試驗(yàn)的成敗，如基因分離、AFLP、RAPD、SSR等。因此，學(xué)習(xí)、掌握DNA提取方法并對(duì)其進(jìn)行比較、總結(jié)，有利于后續(xù)試驗(yàn)的順利開展。國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并使用了許多種DNA提取方法[2-7]，并且針對(duì)不同生物體的具體特點(diǎn)，對(duì)許多方法進(jìn)行了改良，摸索出適用于具體物種的高效方法[8-15]。目前，傳統(tǒng)的SDS法和CTAB法由于其成本低廉、提取的DNA質(zhì)量相對(duì)較好，在實(shí)際應(yīng)用中仍占有主要地位。隨著生物技術(shù)的普及和應(yīng)用，使用試劑盒提取基因組DNA逐漸增多[16-19]?；蚪M提取試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室、特別是普通高等學(xué)校來(lái)說(shuō)，由于價(jià)格較為昂貴，在很大程度上限制了其使用范圍；尤其對(duì)剛接觸分子生物學(xué)試驗(yàn)的初學(xué)者，只知道按照說(shuō)明書流程操作，不了解試劑的化學(xué)成分、具體配制方法及作用，不利于理解、掌握試驗(yàn)的基本原理，動(dòng)手能力差、試驗(yàn)技能得不到提高，最終出現(xiàn)一旦離開試劑盒，什么試驗(yàn)也不會(huì)做的情況。本試驗(yàn)以普通試驗(yàn)動(dòng)物小白鼠作為提取基因組DNA的材料，選取小白鼠的6個(gè)組織部位，分別是肝、脾、腎、尾、肺和心臟，采用提取基因組DNA的經(jīng)典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因組DNA，并對(duì)其質(zhì)量、濃度、純度進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易于操作、質(zhì)量良好的基因組DNA，這對(duì)于今后的試驗(yàn)教學(xué)和科研工作具有重要的指導(dǎo)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 小白鼠購(gòu)自沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 試劑 dNTP、DNA Marker、高保真酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，引物于Invitrogen 北京分公司合成，CTAB和SDS法提取液配制所需藥品購(gòu)自Sigma，其余所用的化學(xué)試劑（氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 SDS提取法 參照中真核基因組DNA提取方法[方案5][1]從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA并作適當(dāng)修改。此流程最初由Palmiter等[20]提出，現(xiàn)在關(guān)于動(dòng)物基因組提取的很多方法都是由此衍生而來(lái)的。其具體步驟如下：

樣品預(yù)處理：解剖小鼠，PBS磷酸緩沖液沖洗各組織部位后，將組織盡量剪碎后分別放入凍存管，液氮速凍后，保存于-70 ℃。其中尾巴部位剪成1 cm左右小段。取小鼠不同部位組織至滅菌研缽中，液氮研磨。研磨好的樣品放入到滅菌離心管中，為了便于試驗(yàn)結(jié)果的比較，將研碎的組織均加入到離心管500 μL刻度處。加入500 μL SNET裂解緩沖液，再加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）使終濃度達(dá)到400 μg/mL，充分混勻后，60 ℃保溫1.5 h。待冷卻至室溫時(shí)加入等體積氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），上下溫柔翻轉(zhuǎn)5 min；12 000 r/min，室溫離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中。加入2.5 μL RNaseA（10 μg/μL），37 ℃保溫30 min除去其中的RNA。加入等體積氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），上下溫柔翻轉(zhuǎn)5 min；12 000 r/min，離心10 min，取上清液到1個(gè)新的1.5 mL離心管中，重復(fù)此操作1次。加入2/3倍體積異丙醇，-20 ℃靜置10 min，沉淀DNA。4 ℃，12 000 r/min離心 10 min 收集沉淀的DNA。用70%的乙醇清洗沉淀，4 ℃12 000 r/min 離心5 min，去上清。用冷凍的無(wú)水乙醇清洗沉淀。4 ℃ 12 000 r/min離心7 min，去上清。室溫干燥DNA。加入20 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB提取法 參照Doyle等的方法[3]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。試驗(yàn)流程絕大部分與SDS法相同，只在劃線處存在變動(dòng)。劃線處試驗(yàn)步驟改為：將研磨好的樣品，加入預(yù)熱好的4×CTAB提取液500 μL，同時(shí)加入10 μL的β-巰基乙醇。

1.2.3 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳 2種方法提取不同組織部位的基因組DNA，每個(gè)樣品吸取1 μL原液，選擇λ-HindⅢ 作為DNA marker，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，30 min，EB染色后，凝膠成像儀（中國(guó)北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司，202D型）拍照保存。

1.2.4 基因組DNA質(zhì)量和濃度測(cè)定 使用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000（Thermo）檢測(cè)DNA 的純度及濃度，分別測(cè)定基因組DNA 在D260 nm 和D280 nm 的吸光度，以及D260 nm/D280 nm 和D260 nm/D230 nm比值。同時(shí)，測(cè)定提取的基因組DNA 的濃度。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 使用小鼠看家基因引物[21]Actin F（5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′）和Actin R （5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′） 進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段長(zhǎng)411 bp。試驗(yàn)采用20 μL體系，成分如下：13.7 μL ddH2O；2.0 μL 10×PCR Ex buffer；2.0 μL dNTP （2.5 mmol/L each）；0.8 μL Actin F（5 mmol/L）；0.8 μL Actin R （5 mmol/L）；0.5 μL DNA模板。提取的12個(gè)基因組DNA樣品，根據(jù)濃度將其稀釋成不同倍數(shù)，達(dá)到終濃度大約為8 ng/μL，用作PCR模板。PCR程序設(shè)為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，0.8% 瓊脂糖電泳檢測(cè)目的基因擴(kuò)增情況。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

SDS法和CTAB法提取6個(gè)組織部位基因組DNA，每個(gè)部位每種方法任選1個(gè)作為代表，吸取1 μL原液，同時(shí)吸取3 μL DNA marker進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示，12個(gè)點(diǎn)樣孔跑出的電泳條帶，除了腎/SDS、心/SDS和心/CTAB條帶較暗外，其余9個(gè)樣品條帶較亮、無(wú)拖尾；與λ-HindⅢ相比較，所有樣品DNA大小均在10 kb左右（如圖2左側(cè)箭頭所示），說(shuō)明提取的基因組DNA完整性較好。但是幾個(gè)濃度大的樣品，點(diǎn)樣孔存在不同程度EB吸收，并且在基因組DNA條帶后方、靠近點(diǎn)樣孔一側(cè)有明亮度不同的條帶，濃度低的樣品則沒(méi)有，而將濃度高的DNA樣品進(jìn)行稀釋后，重新進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，這一現(xiàn)象消失。因此推測(cè)此種現(xiàn)象很可能是由于DNA濃度過(guò)大造成的。脾/CTAB法提取的基因組DNA中的RNA條帶較為明顯。

2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度

采用紫外分光光度法測(cè)定提取的基因組DNA的純度和濃度，D260 nm/D280 nm比值用來(lái)衡量蛋白質(zhì)的去除情況，D260 nm/D230 nm比值用來(lái)衡量鹽分去除情況，結(jié)果如表1所示。2種方法提取6種不同組織部位的基因組DNA，濃度和質(zhì)量方面有很大差異。

在DNA濃度方面，SDS法提取6個(gè)組織部位的基因組DNA中，肝臟濃度最高，達(dá)到了（7 053.60±48.00）ng/μL；心臟最低，平均值只有13.32 ng/μL，兩者濃度相差了500多倍；其余幾個(gè)部位的濃度，從高到低依次為肺>脾>尾>腎。采用CTAB法提取的6個(gè)組織部位的基因組DNA，DNA濃度的數(shù)值也是肝臟最大（2 871.10±67.18）ng/μL，心臟最低（8.27±0.35）ng/μL，這點(diǎn)與SDS法相同，但是所獲得的基因組DNA濃度均低于SDS法。其余4個(gè)部位的DNA濃度，從高到低依次為脾>腎>尾>肺。

在提取的DNA質(zhì)量方面，主要根據(jù)D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值來(lái)衡量。D260 nm/D280 nm的比值可以看出基因組DNA中蛋白質(zhì)和RNA的去除情況。純凈DNA的D260 nm/D280 nm比值應(yīng)為1.8，如果小于1.6說(shuō)明有蛋白質(zhì)、酚等污染，如果大于1.9，證明RNA去除不完全。

從表1可以看出，腎/SDS純度最差，平均值只有1.47；其次是心/SDS和心/CTAB，分別是1.71和1.68；脾/CTAB比值是2.05；而其余幾個(gè)樣品提取的基因組DNA質(zhì)量較好，范圍在1.73～1.86之間。D260 nm/D230 nm的比值可以檢測(cè)出基因組DNA中鹽分的去除情況，如果DNA鹽分去除完全，D260 nm/D230 nm的比值應(yīng)該在2.0以上。提取的所有樣本，除了肺/SDS、尾/SDS、脾/SDS、脾/CTAB和肝/CTAB這5個(gè)樣品的值接近于2.0（在1.93～2.06之間）之外，剩下的7個(gè)樣品的鹽分都沒(méi)有去除完全（0.78～1.73），特別是其中的腎/SDS，比值只有0.78。

2.3 PCR檢測(cè)

將2種方法6種不同組織部位提取的基因組DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，吸取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，以0.5 μL DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1～12號(hào)點(diǎn)樣孔均出現(xiàn)明亮、特異的條帶，條帶大小400多bp，符合目的片段的長(zhǎng)度。同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)任何條帶出現(xiàn)，證明在整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有污染。

3 討論

小白鼠是高校常用的一種試驗(yàn)動(dòng)物，其組織部位由于其細(xì)胞類型、代謝產(chǎn)物等成分的不同，對(duì)不同的提取方法適用性也不一樣。并且由于含有的一些特殊物質(zhì)，導(dǎo)致在基因組DNA提取過(guò)程中，操作的難易度也不一樣。試驗(yàn)共選取了6個(gè)組織部位，肝、脾、腎、尾、肺和心臟，盡管對(duì)樣品進(jìn)行了預(yù)處理（盡量將組織減碎），但是在研磨的難易度上，不同組織部位，差別很大。最容易研磨的部位是肝臟，并且肝臟的樣品量最大，得率也最高；最不容易研磨的部位是尾巴，但是尾部除去漂浮的毛后，含的雜質(zhì)最少，上清液最為清晰，后面的試驗(yàn)操作最為容易。而脾、肺、心的上清液都比較黏稠，后面較難操作。

為了節(jié)省時(shí)間，提高試驗(yàn)效率，將細(xì)胞裂解、釋放基因組DNA的時(shí)間進(jìn)行了改良，即水浴時(shí)間縮短到1.5 h。同時(shí)為了便于比較2種方法的優(yōu)劣，水浴的溫度都定在了60 ℃，觀察紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果，可以看出，除了腎/S、心/S和心/CTAB外，大部分樣品的蛋白都去除得比較徹底。

SDS法提取6個(gè)組織部位得到的基因組DNA，D260 nm/D230 nm的比值普遍都低于2.0，說(shuō)明SDS法提取基因組DNA時(shí)，去鹽不完全，但是從PCR結(jié)果來(lái)看，可以擴(kuò)增出目的基因，說(shuō)明用于普通的分子生物學(xué)操作沒(méi)有問(wèn)題。如果用于要求較高的分子生物學(xué)試驗(yàn)，可以采取無(wú)水乙醇洗滌沉淀DNA、DNA溶于水而不是TE等措施除去多余鹽分，從而進(jìn)一步純化提取的基因組DNA。而腎/SDS相對(duì)腎/CTAB的濃度來(lái)說(shuō)，得率非常低，有可能是SDS法不適合用于提取腎臟部位DNA，腎/SDS的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值（均是最差的數(shù)值）也從另一方面說(shuō)明了SDS方法提取腎臟部位的基因組DNA質(zhì)量稍差。

CTAB法提取的6個(gè)組織部位的基因組DNA濃度，除了肝臟（最高）和心臟（最低）外，其余4個(gè)部位從高到低依次為脾>腎>尾>肺；而SDS法為肺>脾>尾>腎，說(shuō)明在這4個(gè)組織部位中，2種方法各具優(yōu)勢(shì)。根據(jù)D260 nm/D280 nm的測(cè)定結(jié)果，相對(duì)于脾/SDS=1.79的比值，脾/CTAB質(zhì)量稍差，達(dá)到了2.05，說(shuō)明RNA沒(méi)有去除完全，基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖片也說(shuō)明了這一點(diǎn)。另外一個(gè)與SDS法差別較大的是腎臟，SDS法測(cè)的比值只有1.47，而腎/CTAB達(dá)到了1.79。說(shuō)明CTAB法比較合適腎臟部位基因組DNA的提取。

總的來(lái)看，采用SDS和CTAB 2種方法對(duì)小鼠的6個(gè)組織部位基因組DNA進(jìn)行提取，提取的基因組DNA基本都能滿足分子生物學(xué)研究。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖片、DNA的濃度和純度，及PCR擴(kuò)增效果，說(shuō)明SDS和CTAB這2種提取方法，對(duì)于不同的組織部位具有不同的優(yōu)勢(shì)。綜合來(lái)看，小鼠的6個(gè)組織部位中，肝臟最合適用來(lái)作為提取基因組DNA的材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]薩姆布魯克J.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 3版.北京：科學(xué)出版社，2008：461-485.

[2]Basuni A A，Butterworth L A，Cooksley G，et al. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA[J]. Journal of Viral Hepatitis，2000，7（3）：241-243.

[3]Doyle J J，Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull，1987，19：11-15.

[4]Nagori R，Sharma P，Habibi N，et al. An efficient genomic DNA extraction protocol for molecular analysis in annona reticulata[J]. National Academy Science Letters，2014，37（2）：137-140.

[5]王 文，施立明.一種改進(jìn)的動(dòng)物線粒體DNA提取方法[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，1993，14（2）：197-198.

[6]汪永慶，王新國(guó)，徐來(lái)祥，等. 一種動(dòng)物基因組DNA提取方法的改進(jìn)[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2001，36（1）：27-29.

[7]張 寧，王鳳山.DNA提取方法進(jìn)展[J]. 中國(guó)海洋藥物，2004，98（2）：40-46.

[8]Di Bernardo G，Del Gaudio S，Galderisi U，et al. Comparative evaluation of different DNA extraction procedures from food samples[J]. Biotechnology Progress，2007，23（2）：297-301.

[9]Peano C，Samson M C，Palmieri L，et al. Qualitative and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and non-GMO foodstuffs with four different extraction methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（23）：6962-6968.

[10]Wu J，Lin I H，Hayes R B，et al. Comparison of DNA extraction methods for human oral microbiome research[J]. Journal of International Medical Research，2014，4（10）：1980-1991.

[11]趙曉麗，李曉霞，劉德華，等. 3種方法對(duì)臨床菌血癥樣本細(xì)菌DNA提取的比較[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：117-120.

[12]陳國(guó)明，魏海蓮，李志強(qiáng)，等. 平菇DNA不同提取方法比較[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2014，43（1）：73-78.

[13]金 晶，朱 玲，高 軍，等. 三種DNA抽提方法對(duì)新鮮血細(xì)胞及凍血細(xì)胞DNA抽提效能的比較[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（1）：101-105.

[14]李曉曉，趙煥英，楊云廷，等. 三種人全血基因組DNA提取方法的比較[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（27）：5221-5225.

[15]白雪嵩，趙昶靈，陳中堅(jiān)，等. 5種提取三七基因組 DNA 方法的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（5）：54-56.

[16]Kennedy N A，Walker A W，Berry S H，et al. The impact of different DNA extraction kits and laboratories upon the assessment of human gut microbiota composition by 16S rRNA gene sequencing[J]. PLoS One，2014，9（2）：e88982.

[17]Vishnivetskaya T A，Layton A C，Lau M C，et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples[J]. FEMS Microbiology Ecology，2014，87（1）：217-230.

[18]李進(jìn)波，盛 婧，李 想，等. 五種DNA提取方法對(duì)魚加工制品DNA提取效果的比較[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2014（4）：43-49.

[19]郭 妍，惠長(zhǎng)野，張 文，等. 牛肺基因組DNA的提取及其質(zhì)量分析[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2014，27（5）：712-715.

[20]Palmiter R D，Chen H Y，Messing A，et al. SV40 enhancer and large-T antigen are instrumental in development of choroid plexus tumours in transgenic mice[J]. Nature，1985，316（627）：457-460.

[21]王靜華.哺乳小白鼠在不同泌乳階段乳鐵蛋白（lactoferrin）基因表達(dá)的差異及鐵對(duì)其表達(dá)影響的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2004：30-31.張 超，楊永智，王 艦，等. 雙單倍體馬鈴薯DM再生體系的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：50-52.