鉤藤總生物堿的含量測(cè)定研究

許家潔 于江波 徐軍 仲崇琳 楊美林700吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司700吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司00吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院

鉤藤總生物堿的含量測(cè)定研究

許家潔1于江波2徐軍3仲崇琳3楊美林3
133700吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司1
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130012吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院3

目的：建立測(cè)定鉤藤總生物堿含量的方法。方法：用紫外分光光度法測(cè)定鉤藤總生物堿提取物中的鉤藤總生物堿含量。采用高效色譜法測(cè)定鉤藤總生物堿提取物中的鉤藤堿含量。結(jié)果：鉤藤堿的進(jìn)樣量0.168～0.840μg，其峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系（r=0.9995），平均回收率98.98％，RSD=1.31（n=5）。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于鉤藤總生物堿的含量測(cè)定。

鉤藤總生物堿；高效液相色譜法；分光光度法；含量測(cè)定

鉤藤總生物堿主要包括4種生物堿，即鉤藤堿（Rhynchophylline）、異鉤藤堿（Isorhynchophylline）、去氫鉤藤堿（Corynoxeine）（異名柯諾辛因堿）、異去氫鉤藤堿（Isocorynoxeine）（異名異柯諾辛因堿）。其中鉤藤堿與異鉤藤堿、去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿分別為同分立體異構(gòu)體，這些生物堿均為吲哚型生物堿[1]。鉤藤總生物堿具有明顯的降壓活性[2]，系鉤藤藥材主要的活性成分。為了測(cè)定鉤藤總生物堿提取物中鉤藤總生物堿和鉤藤堿的含量，筆者采用紫外分光光度法測(cè)定了鉤藤總生物堿提取物中的鉤藤總生物堿含量；采用高效色譜法測(cè)定了鉤藤總生物堿提取物中的鉤藤堿（Rhynchophylline）含量，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

儀器：日本島津LC-10A高效液相色譜儀；島津SPD-10A紫外檢測(cè)器，N2100液相色譜工作站。

藥品與試劑：鉤藤總生物堿；鉤藤堿對(duì)照品；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

方法：分光光度法測(cè)定鉤藤總生物堿提取物中鉤藤總生物堿含量。①儀器與試藥：752型紫外光柵分光光度計(jì)；鉤藤堿對(duì)照品：自制，純度＞99％。對(duì)照品溶液的配制：精密稱取對(duì)照品適量，加2％鹽酸溶液制成含鉤藤堿100μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL量瓶中，用2％鹽酸溶液稀釋至刻度。以相應(yīng)的溶劑為空白，根據(jù)分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VC）試驗(yàn)，在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。③供試品溶液的制備與測(cè)定：取本品25mg，置于50mL量瓶中，加2％鹽酸溶解并稀釋至刻度。精密吸取2mL，置于100mL量瓶中，用2％鹽酸溶液稀釋至刻度。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法自“以相應(yīng)的溶劑……”起依法操作，測(cè)定供試品吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，即得。④方法學(xué)考察：最大吸收波長(zhǎng)確定：分別吸取鉤藤堿對(duì)照品溶液（50μg/mL），鉤藤總生物堿樣品供試液（100μg/mL），在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，對(duì)鉤藤堿對(duì)照品和鉤藤總生物堿樣品進(jìn)行紫外掃描以確定測(cè)定波長(zhǎng)。⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取鉤藤堿對(duì)照品5.60mg置于50mL量瓶中，加2％鹽酸溶液溶解，稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL量瓶中，用2％鹽酸溶液稀釋至刻度[4]。于波長(zhǎng)250nm處測(cè)定不同濃度的吸收度，以吸收度、濃度作圖。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：按“供試品溶液的制備與測(cè)定”項(xiàng)下方法操作，對(duì)同一的供試液每隔一段時(shí)間測(cè)定吸收度。⑦精密度試驗(yàn)：對(duì)同一供試液，連續(xù)測(cè)定5次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，計(jì)算RSD[5]。⑧重現(xiàn)性試驗(yàn)：對(duì)同一批次鉤藤總生物堿提取物，制備5份供試液，測(cè)定吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。⑨回收率實(shí)驗(yàn)：在已知含量的鉤藤總生物堿提取物（含量75.49％）中，定量加入鉤藤堿對(duì)照品，按樣品測(cè)定方法操作，計(jì)算回收率。⑩按上述方法測(cè)定了5批原料藥。

高效液相色譜法測(cè)定鉤藤堿含量：①色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇-0.02％三乙胺溶液（70：30）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。理論板數(shù)按鉤藤堿峰計(jì)算，應(yīng)≥3000[6-7]。②對(duì)照品溶液的制備：精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL中含鉤藤堿50μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。③供試品溶液的制備：精密稱取50mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，稱重，超聲處理5min，再稱重，用甲醇補(bǔ)足，作為供試品溶液。④線性關(guān)系考察：精密吸取鉤藤堿對(duì)照品溶液（56μg/mL），分別進(jìn)樣3、6、9、12、15μL，按上述條件測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，鉤藤堿濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測(cè)各次峰面積，計(jì)算RSD。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一批號(hào)供試品溶液，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定，每隔2h進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。⑦重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)樣品，按含量測(cè)定方法進(jìn)行多次測(cè)定，計(jì)算RSD。⑧回收率試驗(yàn)：在已知含量12.34％的鉤藤總生物堿提取物中，定量加入鉤藤堿對(duì)照品，按樣品測(cè)定方法操作，計(jì)算回收率。⑨樣品含量測(cè)定：根據(jù)上述方法測(cè)定5批樣品。

結(jié)果

分光光度法測(cè)定鉤藤總生物堿提取物中鉤藤總生物堿含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=-9.8×10-3+0.058X，r=0.9985，線性范圍2.24～11.20μg/mL，見(jiàn)表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸收度值2.5h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表4 5批樣品中鉤藤總生物堿含量測(cè)定結(jié)果

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表6 5批鉤藤總生物堿提取物中鉤藤堿含量測(cè)定結(jié)果

精密度試驗(yàn)：RSD=0.19％（n=5）；重現(xiàn)性試驗(yàn)：RSD=1.23％（n=5），表明本方法有較好的重現(xiàn)性；回收率試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表3。

5批原料藥測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。

高效液相色譜法測(cè)定鉤藤堿含量：線性關(guān)系考察：回歸方程Y=-4700.40+361502.38X，r=0.9999，線性范圍0.168～0.840μg；精密度試驗(yàn)：RSD=1.97％（n=5），表明測(cè)定儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)：RSD=0.87％（n=5）；重現(xiàn)性試驗(yàn)：RSD=2.14％（n=5），表明方法重現(xiàn)性良好；回收率試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表5。

5批樣品測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表6。

討論

最大吸收波長(zhǎng)確定，分別吸取鉤藤堿對(duì)照品溶液（50μg/mL），鉤藤總生物堿樣品供試液（100μg/mL），在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，對(duì)鉤藤堿對(duì)照品和鉤藤總堿樣品進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果鉤藤堿對(duì)照品和鉤藤總堿樣品均在250nm處有最大吸收，故確定λS=250nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

鉤藤堿（Rhynchophylline）與異鉤藤堿（Isorhynchophylline）系同分異構(gòu)體，根據(jù)前期研究，我們發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)在甲醇溶液中存在著相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，造成鉤藤堿測(cè)定結(jié)果的變化，因此在配制樣品溶液過(guò)程中，應(yīng)避免甲醇的使用。

[1]焦揚(yáng),王模強(qiáng),華丹,等.中藥鉤藤化學(xué)成分研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,19（2）：107-109.

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Content determ ination exploration of uncaria totalalkaloid

Xu Jiajie1,Yu Jiangbo2,Xu Jun3,Zhong Chonglin3,YangMeilin3
Liyuan Pharmaceutical Limited Liability Company ofAodong Group in Jilin 1337001
Yanbian Pharmaceutical Limited Liability Company ofAodong in Jilin 1337002
Jilin Province Academy ofTraditionalChineseMedicine 1300123

Objective：To establish themethod for content determination ofuncaria totalalkaloid.Methods：The contents ofuncaria totalalkaloid from uncaria totalalkaloid extractivewere determined by ultravioletspectrophotometry.The contents ofuncaria total alkaloid from uncaria total alkaloid extractive were determined by HPLC.Results：The incoming sample amount of uncaria total alkaloid was 0.168～0.840μg,the peak area and incoming sample amount had good linear relationship（r=0.9995）,the average recovery was 98.98％,RSD=1.31（n=5）.Conclusion：Thismethod was sensitive and accurate,which could be used for the content determination ofuncaria totalalkaloid.

Uncaria totalalkaloid；High Performance Liquid Chromatography；Spectrophotometry；Contentdetermination

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.10.2