不同采收期廣佛手指紋圖譜研究

李金玉，賀文婷，王喜英 (廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州廣東 510300)

廣佛手是蕓香科柑橘屬植物Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot．)Swingle 成熟果實，其性味辛、苦、酸、溫，具有理氣健胃、鎮(zhèn)嘔祛痰之功，治療胸腹脹滿、消化不良、咳嗽、痞滿等癥，為我國傳統(tǒng)中藥［1］。廣佛手主產(chǎn)于廣東化州、德慶武壟、高要悅城、云浮、郁南等地，栽培歷史悠久，為廣東地道藥材“十大廣藥”。不同產(chǎn)地的廣佛手指紋圖譜已有研究［2－3］，但對于不同采收期的廣佛手指紋圖譜研究鮮有報道。筆者對不同采收期廣佛手指紋圖譜進行研究，揭示不同采收期廣佛手成分含量的差異，以期為該藥提供穩(wěn)定、可重現(xiàn)的質(zhì)量控制手段，同時確定廣佛手藥材的最佳采收期，從而實現(xiàn)廣佛手藥材的規(guī)范化種植。

1 材料與方法

1．1 儀器 Waters 2965 HPLC系統(tǒng) (Waters Corporation，Milford，MA，USA)，包括四元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Empower3工作站。

1．2 試藥 橙皮苷(成都植標化純生物技術(shù)有限公司，批號120316，純度≥98%)，5，7-二甲基氧基香豆素(天津希恩思生化科技有限公司，批號D-59430，純度≥98%)，甲醇(色譜純，德國默克公司，批號603－001－00－X)，冰乙酸(優(yōu)級純，天津市科密歐，批號20110513);其余所用試劑皆為分析純。所用20批廣佛手藥材均采自廣東省高要市回龍鎮(zhèn)廣佛手基地，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵教授鑒定為佛手Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot．)Swingl的果實。藥材情況如表1所示。

1．3 方法

1．3．1 色譜條件。色譜柱Kromasil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，檢測波長 283 nm，流速 1．0 ml/min，柱溫 30 ℃;進樣量20 μl。流動相為甲醇(A)/0．5%乙酸水(B)，梯度洗脫，線性梯度程序如表2所示。

表2 線性梯度洗脫程序

1．3．2 對照品溶液的制備。分別精密稱定橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素對照品，用甲醇溶解稀釋、定容，配制成0．20和0．50 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。

1．3．3 供試品溶液的制備。各藥材低溫干燥后，粉碎，使全部通過80目篩。精密稱取藥材粉末2．50 g，置具塞三角瓶中，加入甲醇25 ml超聲處理2次，每次30 min，濾過，合并濾液，低溫真空回收溶劑，殘渣用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶，取適量過0．22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

1．3．4 方法學(xué)考察。

1．3．4．1 精密度試驗。同一廣佛手供試品溶液連續(xù)進樣5次，每次20 μl，記錄色譜圖，測得各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，說明儀器精密度良好。

1．3．4．2 重復(fù)性試驗。取1 號樣品 6 份，依據(jù)“1．3．3”方法制備，分別進樣20 μl，記錄HPLC色譜圖，測得色譜圖中各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，說明儀器重復(fù)性良好。

1．3．4．3 穩(wěn)定性試驗。精密吸取1號供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣 20 μl，測得各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2．1 廣佛手指紋圖譜建立 選取不同采收期的廣佛手藥材20 批，按“1．3．3”方法制備供試品溶液，分別進樣20 μl，記錄HPLC色譜圖。將20批樣本指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004 A版)進行數(shù)據(jù)處理，選擇橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素2個色譜峰進行多點校正，色譜峰自動匹配后，以中位數(shù)法生成不同采收期廣佛手指紋圖譜及共有模式指紋圖譜。從圖1～2可以看出，同一采收期內(nèi)的樣本指紋圖譜差異性較小，而2個不同采收期指紋圖譜之間差異較為明顯，說明不同生長期內(nèi)廣佛手中化學(xué)成分的種類及含量存在一定差異。經(jīng)過對這20批樣品的測試分析和多次研究比較，歸納確定廣佛手的HPLC指紋圖譜具有23個共有的基本特征峰。

2．2 廣佛手藥材共有峰的確定 采用相對保留時間標定共有指紋峰，20批不同采收期廣佛手藥材共有23個共有峰。其中16號和19號為橙皮苷和5，7－二甲氧基香豆素。以保留時間為60．989 min的16號色譜峰作為參照峰，計算20批樣本共有峰相對保留時間、相對峰面積(表3～4)。

表3 20批樣本共有峰相對保留時間

2．3 指紋圖譜的相似度評價 采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004 A版)，對不同采收期廣佛手樣品進行相似度計算，通過與系統(tǒng)建立共有模式比較。由相似度計算結(jié)果(表5)可見，9月份采收的樣本整體相似度高于7月份采收的樣本;20批次樣本的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均不低于0．94，考慮到生產(chǎn)中的各種變化因素，規(guī)定廣佛手的指紋圖譜與對照指紋圖譜間的相似度應(yīng)不低于0．85，反之為不合格。

表4 20批樣品共有峰相對峰面積

續(xù)表4

表5 不同采收期廣佛手相似度數(shù)據(jù)

3 討論

3．1 色譜條件的選擇 該試驗考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0．5% 磷酸水溶液、甲醇－0．3%乙酸水溶液、甲醇－0．5%乙酸水溶液等多種流動相體系，以甲醇－0．5%乙酸水溶液系統(tǒng)洗脫可使色譜峰較好地分離，故選用該系統(tǒng)。該試驗經(jīng)DAD檢測器分析，得到210～400 nm波段的三維掃描圖，根據(jù)圖譜選擇各成分紫外吸收均較強的波長，在283 nm處，色譜圖中各色譜峰信號豐富，所以選定283 nm為檢測波長。

3．2 參照峰的選擇 2010版藥典主要通過控制橙皮苷的含量對佛手藥材的質(zhì)量進行控制，同時佛手中5，7－二甲氧基香豆素含量相對較高，所以廣佛手指紋圖譜共有峰以兩者為參照峰。

3．3 不同采收期指紋圖譜比較 7月份采收的樣本為尚未成熟的廣佛手果實，而9月份采收的樣本為近成熟至成熟的果實。9月份采收的樣本整體相似度高于7月份采收的樣本，可能由于9月份樣本已近成熟或成熟，果實內(nèi)化學(xué)成分的種類及含量趨于穩(wěn)定。同一采收期內(nèi)的樣品指紋圖譜差異性較小，而2個不同采收期指紋圖譜之間差異較為明顯，說明不同生長期內(nèi)廣佛手中化學(xué)成分的種類及含量存在一定差異。

［1］國家藥典委員會．中國藥典(一部)［S］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:167．

［2］林樂維，蔣林，郝大慶，等．不同產(chǎn)地廣佛手藥材HPLC指紋圖譜的研究［J］．中成藥，2009(12):1805 －1808．

［3］張瑞芳，高幼衡，崔紅花，等．廣佛手藥材HPLC指紋圖譜的研究［J］．中草藥，2007(7):1075－1077．