北沙參不定根誘導及懸浮培養(yǎng)研究

苗曉燕，王 琳 (保定學院生化系，河北保定071000)

北沙參(Radix Glehniae)，又名海沙參、野沙參、羊乳根等，為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidtex Miq)的根，為沙參屬多年生草本植物，山東、河北、內(nèi)蒙、遼寧為其主產(chǎn)區(qū)。其嫩莖葉均可入蔬，其根為著名的中藥材，與人參、玄參、丹參、黨參并稱為五參。研究表明，北沙參的主要活性成分有歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、補骨質(zhì)素等14種香豆素，還有一種香豆素苷元、多糖、生物堿及揮發(fā)油等。藥理學研究和臨床實踐表明香豆素類成分是主要的有效成分，具有止咳化痰［1］、抗突變［2］、抗菌［3］、抗腫瘤［4］和鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜［5］等作用。

目前，利用生物技術進行重要資源繁殖并大規(guī)模生產(chǎn)其有效成分已成為一條新的發(fā)展途徑。其中根培養(yǎng)可以使次生代謝產(chǎn)物的合成能力明顯提高［6］。近年來，國內(nèi)外通過培養(yǎng)不定根生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的研究日益活躍，此技術已在人參［7－9］、白術［10］、甘草［11］等植物中獲得成功。筆者擬采用不同途徑獲得北沙參不定根，進而探究NAA、IBA及蔗糖對其不定根增殖的影響，以期為后續(xù)利用生物反應器大量擴繁北沙參不定根提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 北沙參，采集于安國藥材種植基地。

1.2 儀器與設備 低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)、電子天平(LP303型，常熟市衡器廠)、全溫振蕩器(中國哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)

1.3 方法

1.3.1 北沙參不定根誘導。取新生北沙參的的葉片和莖段為外植體，自來水沖洗10 min，移至超凈工作臺，用70%乙醇泡20 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，無菌水洗滌3次，無菌濾紙吸干。

方法1:用解剖刀切成1 cm左右莖段，接種于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培養(yǎng)基中，pH 5.8，溫度(25±1)℃，暗培養(yǎng)。

方法2:用解剖刀將葉片表面劃傷，接種于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培養(yǎng)基中，pH 5.8，溫度(25±1)℃，暗培養(yǎng)。

方法3:取一定量保定學院生化系細胞生物學實驗室誘導的愈傷組織［12］，轉(zhuǎn)接至 MS 液體培養(yǎng)基中，pH 5.8，(25 ±1)℃，110 r/min振蕩培養(yǎng)20 d。

1.3.2 蔗糖濃度對北沙參不定根生長的影響。將不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分別接種于含不同濃度蔗糖(10、20、30、40、50 g/L)的MS 液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養(yǎng)21 d收獲。

1.3.3 IBA濃度對北沙參不定根生長的影響。將不定根剪成0.5 ～1.0 cm 的小段，分別接種于含不同濃度 IBA(1、2、3、4、5、6 mg/L)的MS(上述適宜濃度蔗糖)液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養(yǎng)21 d收獲。

1.3.4 NAA濃度對北沙參不定根生長的影響。將北沙參不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分別接種于含不同濃度NAA(0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg/L)的 MS+IBA(上述適宜濃度)+蔗糖(上述適宜濃度)液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度(25±1)℃，振蕩培養(yǎng)21 d收獲。

1.3.5 北沙參不定根生長曲線的測定。將北沙參不定根接種至100 ml MS培養(yǎng)基中(含上述篩選出的合適濃度IBA、蔗糖和NAA)，置于搖床(25℃，110 r/min)中振蕩培養(yǎng)。分別在第0、3、6、9、12、15、18、21 天隨機取出3 瓶，測定其生長量。

1.3.6 北沙參生物量的測定。將培養(yǎng)至21 d的不定根取出，濾紙吸干水分，稱重即為濕重;50℃烘干后，再稱重即為干重。

2 結果與分析

2.1 不同途徑誘導北沙參不定根情況 由圖1可知，3種不同途徑均可誘導出不定根，但從誘導出的不定根狀態(tài)來看，葉片和莖段誘導出的根較纖細，數(shù)量較少。而由愈傷組織誘導出的不定根粗壯，細長，乳白色，且生長速度快。因此，愈傷組織誘導不定根作為獲得北沙參不定根是較簡單和理想的途徑。

2.2 不同濃度蔗糖對北沙參不定根生長的影響 研究發(fā)現(xiàn)，當蔗糖濃度較低時，根的生長速度緩慢，分支少，隨著蔗糖濃度的增加，不僅鮮重和干重呈加速上升的趨勢，且根的顏色呈白色，分支增多。由圖2可知，濃度為40 g/L的不定根鮮物重(4.48 g)和干物重(0.54 g)達到最大值，之后生長量呈較穩(wěn)定的趨勢，說明較低濃度的蔗糖溶液不利于不定根的生長，適當增加濃度可加速不定根的生長，但濃度過高則又會抑制其生長，這可能與高濃度蔗糖導致細胞內(nèi)滲透壓過高有關［13］。因此較適合不定根生長的蔗糖濃度為40 g/L。

2.3 不同濃度IBA對北沙參不定根生長的影響 分別考察了1、2、3、4、5、6 mg/L 共6 個濃度 IBA 對北沙參不定根增殖的影響。由圖3可知，隨IBA濃度升高，北沙參不定根的鮮物重和干物重均呈增加趨勢，當IBA濃度達到4 mg/L時，鮮物重(5.93 g)和干物重(0.69 g)均達到最大值，此時北沙參不定根生長狀態(tài)最好，新長出來的不定根新鮮，根系粗壯，顏色乳白，生長旺盛。當IBA濃度繼續(xù)增加時，培養(yǎng)的不定根顏色逐漸變?yōu)楹稚?，部分開始死亡，且鮮重和干重均呈逐漸下降趨勢。說明過高濃度的IBA對北沙參不定根的生長具有一定的抑制作用。

2.4 不同濃度NAA對北沙參不定根生長的影響 由圖4可知，當用0.8 mg/L NAA處理北沙參不定根時，其生長狀態(tài)最好，鮮物重(7.44 g)和干物重(0.75 g)均達到最大值。且發(fā)現(xiàn)，隨著NAA濃度的提高，北沙參不定根會發(fā)生輕微的愈傷化，即在根的周圍出現(xiàn)透明隆起，且培養(yǎng)基中出現(xiàn)一定的小細胞團。因此，綜合考慮北沙參不定根的生長狀態(tài)及生物量，發(fā)現(xiàn)0.8 mg/L NAA較適合北沙參不定根的生長。

2.5 北沙參不定根生長曲線 分別在不定根生長的不同天數(shù)(0、3、6、9、12、15、18、21 d)進行取樣測定其生長量，結果見圖5。由圖5可知，北沙參不定根的生長曲線呈近S型，0～3 d為延滯期，3～12 d不定根快速生長，進入對數(shù)生長期，12 d后趨于平穩(wěn)，生物量略有下降。說明隨著北沙參不定根的生長，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，當不能滿足根的生長時，根將逐漸出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象。

3 結論與討論

該試驗采用3種途徑進行北沙參不定根的誘導，結果表明，利用愈傷組織在MS培養(yǎng)基中能較快速地獲得不定根。隨后又考察了IBA、NAA和蔗糖3種因素對北沙參不定根生長的影響，發(fā)現(xiàn)當蔗糖濃度為40g/L、IBA濃度為4mg/L、NAA濃度為0.8 mg/L時，較有利于不定根的生長，可明顯提高其生物量，這說明適宜比例的NAA和IBA組合對植物不定根的形成和生長具有一定的促進作用。這將為后續(xù)利用生物反應器大規(guī)模生產(chǎn)北沙參不定根獲取重要代謝產(chǎn)物——香豆素奠定基礎。

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