豬奇異變形桿菌的分離與鑒定

劉澤文，袁芳艷，田永祥，周丹娜，楊克禮，段正贏，郭銳

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064)

2013～2014年，湖北省江夏某豬場(chǎng)的保育豬發(fā)生以體溫升高達(dá)、食欲廢絕、皮膚蒼白、繼而腹瀉、水樣糞便中雜有黏液為主要癥狀的病例。筆者通過臨床解剖、病原分離鑒定、生化鑒定，確定為豬奇異變形桿菌感染。

1 材料與方法

1.1 病料采集 從湖北江夏某規(guī)模化豬場(chǎng)采集發(fā)病豬小腸、盲腸內(nèi)容物及腸系膜淋巴結(jié)、肺臟及肺門淋巴結(jié)等。

1.2 培養(yǎng)基 用于分離和鑒定的培養(yǎng)基為TSA瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、S.S瓊脂平板等，按常規(guī)方法配制。

1.3 細(xì)菌的培養(yǎng) 無菌采取病豬病料，接種TSA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選菌落分別接種TSA瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和S.S瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察細(xì)菌在各培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.4 細(xì)菌的鑒定

1.4.1 鏡檢。挑選S.S瓊脂平板培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，通過革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4.2 生化試驗(yàn)。將S.S瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌液按常量接種于微量生化管內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～20 h，觀察結(jié)果。

1.4.3 分離菌株的毒力試驗(yàn)。將分離菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)16～20 h，用S.S平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，然后用生理鹽水將菌株肉湯培養(yǎng)物分別稀釋成5×107、1×108、1.5×108、2.0×108CFU/ml。每個(gè)稀釋滴度腹腔注射昆明小鼠5只，每只0.2 ml，另5只小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 ml/只作為空白對(duì)照，注射后觀察7 d，根據(jù)小鼠的死亡情況確定菌株的毒力。

1.5 藥敏試驗(yàn) 將分離純化的菌株按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)［1］。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離及生長(zhǎng)特性 將接種病料的TSA瓊脂平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，可見細(xì)菌在TSA瓊脂平板上生長(zhǎng)較快，菌落覆蓋整個(gè)平板。

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性 將TSA平板上分離的細(xì)菌分別接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和S.S瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后，細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)很快，由細(xì)菌接種點(diǎn)向周圍遷徙性擴(kuò)散生長(zhǎng)的灰色平鋪菌落，且以接種點(diǎn)為中心形成水波紋狀圓心圈，覆蓋整個(gè)平板;分離菌株接種于麥康凱平板中，不形成粉紅色菌落;細(xì)菌在S.S瓊脂培養(yǎng)基上呈單個(gè)菌落生長(zhǎng)，時(shí)間較長(zhǎng)后菌落中心呈黑色。

2.3 細(xì)菌的形態(tài)特征 從S.S瓊脂平板上挑選單個(gè)菌落，經(jīng)涂片、革蘭氏染色，在油鏡下觀察可見細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，呈球形或絲狀，大小不等，無芽孢和莢膜。

2.4 生化鑒定結(jié)果 按照常規(guī)方法進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果如表1所示。

2.5 菌株毒力試驗(yàn)結(jié)果 不同稀釋滴度的分離菌株腹腔注射小鼠后，記錄小鼠的死亡情況。由表2可知，每只小鼠腹腔接種3.0×107CFU分離菌株可致小鼠全部發(fā)病死亡。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，分離的奇異變形桿菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮和丁胺卡那霉素等高度敏感，臨床上可用該藥對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行治療。

表3 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

(1)奇異變形桿菌是人和動(dòng)物的一種常見的條件性致病菌，廣泛分布于人和動(dòng)物的體表、黏膜及消化道，其產(chǎn)生的毒素可引起中毒［2］。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，可感染人和動(dòng)物，引起發(fā)病。在我國(guó)已有關(guān)于奇異變形桿菌導(dǎo)致豬、雞和犢牛［3］發(fā)病的報(bào)道。近年來，我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)經(jīng)常發(fā)生由奇異變形桿菌單獨(dú)引起或繼發(fā)感染病例的發(fā)生，該病已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一種新的細(xì)菌性傳染病。另外，奇異變形桿菌引起人的原發(fā)性和繼發(fā)性感染，新生兒臍帶感染該菌后導(dǎo)致高死亡性的菌血癥和腦膜炎，同時(shí)也可以污染食物，造成人類食物中毒。因此，對(duì)這種豬的新的細(xì)菌傳染病應(yīng)引起高度重視。

(2)筆者在2013～2014年從湖北省江夏、咸寧等地區(qū)多個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)采集病料，通過病原分離、生化鑒定確定該病是由奇異變形桿菌感染引起的。豬感染奇異變形桿菌后，主要表現(xiàn)為體溫升高，有時(shí)可高達(dá)42℃以上，咳嗽，病豬氣喘，肺部聽診，濕性羅音明顯。病理剖檢發(fā)現(xiàn)，病死豬的肺明顯腫脹，呈紅色肝變，觸之堅(jiān)實(shí)，氣管和支氣管內(nèi)充以大量白色泡沫樣黏液。肺門淋巴結(jié)腫脹，充出血，切面濕潤(rùn)，呈大理石樣變。

(3)奇異變形桿菌兼性厭氧，對(duì)營(yíng)養(yǎng)無特殊要求，其在普通瓊脂平板上可蔓延成波紋狀薄膜布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，也是本屬細(xì)菌的特征，這一特征也為奇異變形桿菌的分離提供了便利。小鼠腹腔注射3.0×107CFU/只可引起小鼠全部發(fā)病死亡，結(jié)果表明分離鑒定的奇異變形桿菌對(duì)昆明小鼠有較強(qiáng)的致病能力;藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮和丁胺卡那霉素高度敏感，臨床上常用該類藥物對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行治療。

(4)奇異變形桿菌的防治措施主要包括:①預(yù)防措施。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)對(duì)豬場(chǎng)環(huán)境和每個(gè)豬舍進(jìn)行嚴(yán)格消毒，同時(shí)用敏感藥物進(jìn)行拌料或飲水，可以在一定程度上預(yù)防該病的發(fā)生。②藥物治療。豬奇異變形桿菌容易對(duì)臨床常用的抗生素產(chǎn)生耐藥性［4］，因此在確診該病病原后應(yīng)根據(jù)細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用敏感的頭孢類藥物、硫酸丁胺卡那霉素等抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防和治療。若有嚴(yán)重脫水的仔豬，則另外加服補(bǔ)液鹽水和電解多維溶液。

［1］倪語星，尚紅.臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:57－63.

［2］W·A 黑根.家畜傳染?。跰］.7版.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1988:83－84.

［3］劉澤文，袁芳艷，田永詳.豬奇異變形桿菌病的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(12):3578 －3579.

［4］夏修三，宋翠云，金秋平，等.34株奇異變形桿菌的檢出及藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果分析［J］.淮海醫(yī)藥，2013，31(3):238－239.