響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌B91發(fā)酵培養(yǎng)基

孟利強，趙曉宇，陳靜宇，李 晶，張淑梅，曹 旭，胡基華，沙長青

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150010;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150020;3.黑龍江省科學(xué)院條件財務(wù)處，黑龍江哈爾濱150001)

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性好氧細菌，能產(chǎn)生蛋白酶、抗生素、抗菌多肽等多種物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)保、畜牧和生物防治等領(lǐng)域［1］?？莶菅挎邨U菌的微生態(tài)制劑可以作為飼料或肥料的添加劑來防治動物疾病和植物病害，制劑中活菌數(shù)是衡量其質(zhì)量的重要指標(biāo)［2］。而微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)會隨著其存放時間的延長而減少，最終影響其使用效果，這一問題可以通過提高芽孢桿菌制劑的芽孢比例得以緩解［3］。芽孢是芽孢桿菌的休眠體，具有多種抗逆特性，可以延長微生態(tài)制劑的保存期并保證其使用效果［4］。

在工業(yè)化生產(chǎn)中，由于液體發(fā)酵的各個工藝參數(shù)易于控制，已成為主要的發(fā)酵手段，然而在枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)過程中由于芽孢形成不穩(wěn)定和菌數(shù)低等因素，給實際生產(chǎn)帶來不便［5］?？莶菅挎邨U菌B91是黑龍江省生物工程重點實驗室的自有菌株，是一株具有光譜抑制植物病原真菌能力的細菌，能夠防治多種植物病害，具有廣泛的應(yīng)用前景。筆者對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期實現(xiàn)該菌株的高密度培養(yǎng)的同時提高芽孢形成率，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 枯草芽孢桿菌B91由黑龍江省生物工程重點實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，瓊脂15 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

1.2.2 種子培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉 3 g/L，K2HPO42 g/L，CaCO32 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉 3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO40.01 g/L，CaCO32 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

上述培養(yǎng)基滅菌條件均為濕熱滅菌:121℃，20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子活化。將枯草芽孢桿菌B91轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)。挑一環(huán)斜面種子接種于250 ml三角瓶種子培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量為20 ml，30℃、75 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)。將種子液以2%接種量接種于三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量為50 ml，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.4 芽孢計數(shù)方法 將待測樣品置于80℃水浴處理15 min，使未形成芽孢的菌體失活，自然冷卻后采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，所得結(jié)果即為待測樣品中的芽孢數(shù)［6］。

1.5 Plackett-Burman設(shè)計 采用Plackett-Burman進行試驗設(shè)計，篩選基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的顯著因子，對培養(yǎng)基的7個組分，即葡萄糖(A)、酵母膏(B)、氯化鈉(D)、K2HPO4(E)、MgSO4(G)、MnSO4(H)、CaCO3(K)進行全面考察。選擇10因子2水平的試驗設(shè)計，增加3個空項C、F、J來估計試驗誤差，每個因子取高低2個水平，且高水平是低水平的1.5倍(表1)。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因子與水平

1.6 爬坡試驗 通過對Plackett-Burman設(shè)計的試驗結(jié)果進行分析，確定主要因子，根據(jù)回歸方程各因子的系數(shù)來確定主要因子的爬坡路徑和步長［7］。改變各主要因子在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度，使其成梯度變化，檢測各個梯度下發(fā)酵液芽孢數(shù)量，快速確定最大響應(yīng)值的區(qū)域。

1.7 響應(yīng)面分析 Plackett-Burman設(shè)計確定了影響B(tài)91菌株發(fā)酵芽孢濃度的3個主要因子，爬坡試驗確定了3個主要因子響應(yīng)區(qū)域的中心點，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理在主要因子的響應(yīng)區(qū)各取3個水平，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。

1.8 數(shù)據(jù)分析 一個處理包含3個平行試驗，取值為3個平行試驗的均值。Plackett-Burman設(shè)計采用Minitab 16軟件完成，Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面分析由Design-Expert 8.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計篩選顯著因子 采用Plackett-Burman設(shè)計對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的7個組分進行分析，各組分分別取高低2個水平(表2)，各因子水平方差分析結(jié)果見表3。

由表3中P值的大小可以判定，培養(yǎng)基中各因子對B91菌株發(fā)酵液芽孢濃度影響的重要性排序為A＞B＞H＞G＞D＞E＞K，即葡萄糖、酵母膏和MnSO4的影響較為突出，由相關(guān)系數(shù)可以判定葡萄糖和酵母膏對芽孢數(shù)量的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，而MnSO4呈現(xiàn)負效應(yīng)。這些效應(yīng)關(guān)系由回歸模擬方程表示為Y=19.9+1.98A+1.82B －0.400D+0.267E+0.583G－1.18H －0.150K，R2=0.956 4，這表明該方程式擬合較好。

表2 Plackett-Burman設(shè)計及響應(yīng)值

表3 Plackett-Burman設(shè)計顯著因子分析

2.2 爬坡試驗 爬坡試驗是一種快速逼近最大響應(yīng)值穩(wěn)定響應(yīng)區(qū)的方法，根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計篩選出的顯著因子及其相關(guān)系數(shù)來設(shè)計它們的爬坡路徑和步長(表4)。其中第2組試驗發(fā)酵芽孢濃度最大，即當(dāng)葡萄糖濃度為10.0 g/L，酵母膏濃度為7.0 g/L，MnSO4濃度為 0.010 0 mg/L 時發(fā)酵芽孢濃度達到最大值，所以以此為中心點進行響應(yīng)面試驗分析。

表4 爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 響應(yīng)面試驗分析 確定了顯著因子的最適濃度區(qū)域之后，即以葡萄糖 10.0 g/L，酵母膏 7.0 g/L，MnSO40.010 0 mg/L為中心點進行響應(yīng)面分析試驗，各因素代碼和水平見表5。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理在3個主要因素的響應(yīng)區(qū)各取3個水平，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，每個處理設(shè)定3個重復(fù)試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表6。根據(jù)表6結(jié)果，以芽孢濃度為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0 分析。

方差分析結(jié)果表明，該模型的一次項和二次項對芽孢濃度的影響均顯著，而交互作用對芽孢濃度的影響不顯著;回歸模型的P值為0.000 1，表明模型是顯著的，而失擬項的P值為0.217 8，失擬不顯著;模型的決定系數(shù) R2=0.978 4，說明模型達到較好的擬合程度［8－9］。經(jīng)分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程:

Y=41.16 －2.81A －1.29B+1.20C －1.12AB+0.55AC+2.65BC －4.17A2 －7.62B2－5.74C2

為解得該回歸方程的極值點，對其各自變量分別求一階偏導(dǎo)，得到三元一次方程組，解出該模型的極值點，從而計算出對應(yīng)因素的取值:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏 6.93 g/L，Mn-SO410.16 mg/L，此時模型的理論最優(yōu)芽孢濃度為41.695 4×108cfu/ml。

根據(jù)擬合回歸方程采用Design-Expert 8.0分析，繪出主要因素相應(yīng)的等高線和相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖(圖1～3)。每個響應(yīng)曲面能夠反映出2個主要因素之間的相互作用，在第3個因素固定在最優(yōu)值不變的情況下，隨著另外2個因素的逐漸增加，芽孢濃度呈先增加后減小的趨勢，而曲面的頂點即為芽孢濃度的最大值點［10］。

2.4 驗證試驗 根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，枯草芽孢桿菌B91菌株芽孢濃度最優(yōu)極值為葡萄糖9.35 g/L、酵母膏 6.93 g/L、MnSO410.16 mg/L，預(yù)測最優(yōu)值為41.695 4 ×108cfu/ml。為了驗證這一結(jié)果的有效性，按照上述分析結(jié)果進行重復(fù)試驗，檢測結(jié)果為(41.89 ±0.21)×108cfu/ml，與預(yù)測值相近，說明該模型擬合的有效性?？莶菅挎邨U菌B91菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏6.93 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.16 mg/L，CaCO30.2 g/L。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基的優(yōu)化是微生物菌種從實驗室走向工業(yè)化生產(chǎn)的第一步，而對于芽孢桿菌微生態(tài)制劑而言，其中的芽孢含量才是其質(zhì)量的保證，該研究從實驗室自有枯草芽孢桿菌B91的培養(yǎng)基優(yōu)化入手，提高其發(fā)酵產(chǎn)物細胞濃度和芽孢形成率。在培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，Plackett-Burman設(shè)計可以從眾多的培養(yǎng)基組成成分中篩選出對目標(biāo)產(chǎn)物影響最為顯著的幾個因子。而響應(yīng)面分析法可以同時對響應(yīng)值的幾個變量進行回歸分析，能分析多種因素間的相互作用，同時能通過回歸方程預(yù)測響應(yīng)值的最優(yōu)值［11－12］。目前，國內(nèi)外許多研究者采用該方法對不同微生物的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，均獲得了較為理想的試驗結(jié)果。李志華［13］利用響應(yīng)面法對谷氨酸棒桿菌CN1021的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，結(jié)果谷氨酸產(chǎn)量比未優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基提高了22.75%;王永宏等［14］利用響應(yīng)面法對YL001菌株的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，結(jié)果菌株抗菌活性達268.9 U/ml，與預(yù)測值相符;黃麗金等［15］采用響應(yīng)面方法對德氏乳桿菌保加利亞亞種LB14增殖培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，在優(yōu)化培養(yǎng)基中LB14的菌體濃度比優(yōu)化前提高了近5倍;Muthu等［16］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了嗜鹽細菌VKMM 013的培養(yǎng)基，使其菌體濃度提高了2.4倍。

該研究采用Plackett-Burman設(shè)計從B91菌株基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個組分中篩選出3個顯著因子:葡萄糖(A)、酵母膏(B)和MnSO4(C)，然后利用爬坡試驗快速逼近最大響應(yīng)值的穩(wěn)定響應(yīng)區(qū)，并用響應(yīng)面分析法的Box-Behnken設(shè)計確定顯著因子的最優(yōu)配比:葡萄糖9.35 g/L、酵母膏 6.93 g/L、MnSO410.16 mg/L。最終確定了枯草芽孢桿菌B91的最優(yōu)培養(yǎng)基配方:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏6.93 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.16 mg/L，Ca-CO30.2 g/L。經(jīng)驗證試驗檢測結(jié)果為(41.89±0.21)×108cfu/ml，與預(yù)測值相近，說明該模型擬合的準(zhǔn)確性和試驗結(jié)果的有效性。

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