亳芍組織培養(yǎng)研究

李文峰，馬宗新，馬同富(.阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽阜陽236065;2.阜陽師范學(xué)院，安徽阜陽23604)

亳芍即白芍，是《中國藥典》中以“亳”字命名的中藥材之一，亳州地產(chǎn)藥材，指芍藥科植物芍藥或其變種毛果芍藥栽培品的根。該植物為毛茛科多年生草本植物，花大而美麗，一般種植3～5年，9～10月采挖，去泥后放入開水中煮5～15 min，撈出后去皮曬干即可。加工后的芍藥呈粉白色或白色，故又稱“白芍”［1］?！端幍洹贩Q亳芍。其性微寒，味微苦而酸。其根入藥有平抑肝陽、斂陰養(yǎng)血、收汗緩中之功效，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙的作用，主治月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)前腹痛、盜汗、頭痛等。亳芍的產(chǎn)量約占全國的70%以上［2］。近年來由于反復(fù)種植該物種，產(chǎn)生眾多的土壤病害，其產(chǎn)量受到了極大的威脅，因此亟待對其擴(kuò)繁育苗進(jìn)行研究［3－4］。筆者以種質(zhì)快繁為目的，對亳州芍藥組培、脫毒快繁關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究，以期為其幼苗提供質(zhì)量保障，并為農(nóng)民獲得安全放心苗提供技術(shù)依托。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試品種來自于安徽省亳州市中藥材研究基地，以嫩芽為供試材料。

1.2 試驗(yàn)時間和地點(diǎn) 于2013年10月至2015年5月，在阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物工程研發(fā)中心進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L，擴(kuò)大培養(yǎng)基為 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.025 mg/L，生根培養(yǎng)基為 MS+IBA 0.025 ～0.05 mg/L。設(shè)計(jì)2種不同激素組合培養(yǎng)愈傷組織(表1)。所有培養(yǎng)基均附加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH為5.9～6.1，120℃滅菌30～35 min。

表1 基本培養(yǎng)基MS中激素配比情況 mg/L

1.4 外植體的消毒 采用的外植體為芍藥的嫩芽，由于嫩芽與外界土壤直接接觸，受菌類感染的機(jī)會很大，所以消毒過程十分重要。嫩芽先用清水清洗，剝?nèi)ネ鈱拥镊[片，切除基部受傷部分，用適量洗潔精浸泡15 min，再用流水沖洗20 min;然后在超靜工作臺上先用75%乙醇消毒10 s，再用0.2%HgCl2消毒 10 min，最后用無菌水沖洗多次［5］。各處理均接種5瓶。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材和放置時間不同對莖尖組培的影響 經(jīng)過2年的對比試驗(yàn)結(jié)果表明，2月份取材的亳芍地下嫩芽在成活率、生長狀況均優(yōu)于10月取材的地下嫩芽(表2)。2月份取材的芍藥地下嫩芽不僅污染率低于10月份取材的相同品種，且生長勢強(qiáng)。原因在于2月份取材的地下嫩芽經(jīng)過低溫過程，休眠被低溫打破，且營養(yǎng)儲備時間長，芽體健壯。因此，亳芍地下嫩芽的取材應(yīng)以2月份為宜，選取個體中等、尚未完全展開的地下嫩芽。

表2 取材時間對成活率的影響 %

材料放在基質(zhì)中，隨著放置時間的減小，地下嫩芽污染率從65.2%降低至28.1%;褐化率從60.3%升高至85.3%;成活率從34.8%升高到71.9%(表3)。原因是隨著地下嫩芽放置時間的延長，其組織細(xì)胞失水，細(xì)胞活性降低，從而抵抗病菌的能力降低，消毒的效果也越差。所以，在相同材料的前提下，放置時間越短的植物材料成活率越高，但其褐化率也高。因此，地下嫩芽放置時間要綜合考慮污染率和褐化率，對于不同放置時間的地下嫩芽，應(yīng)選擇不同的處理。放置到基質(zhì)中的地下嫩芽比無處理的地下嫩芽的污染率低。材料無處理時，放置3 d后，成活率為0。由于放置到基質(zhì)中的地下嫩芽鱗片之間貼合緊密，空隙少，雜菌進(jìn)入幾率小;其次，健壯地下嫩芽的生理活性高，生長勢強(qiáng)，不易感染病菌。因此，亳州芍藥組織培養(yǎng)應(yīng)選取生長健壯、飽滿的地下嫩芽。如果地下嫩芽輕微失水，應(yīng)將芽放置于基質(zhì)內(nèi)，然后再進(jìn)行組織培養(yǎng);若地下嫩芽失水嚴(yán)重，就不能用它作為組培材料。

表3 放置時間對成活率的影響 %

2.2 芽和愈傷組織在不同時間段的生長狀況 以飽滿的地下嫩芽為接種材料，選用 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，觀察30 d的生長情況。結(jié)果表明，前10 d芽的高度、直徑和重量變化很小;第20天及第30天時，第30天重量是第20天的2倍，芽的高度和芽體直徑增長較為明顯，芽體生長較迅速(表4，圖1)。因此，擴(kuò)大培養(yǎng)時間應(yīng)在30 d前后進(jìn)行，此時間段芽體生長較旺盛，對擴(kuò)大培養(yǎng)十分有利。

表4 培養(yǎng)基上芽的生長狀況

挑取芽體基部的愈傷組織接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg/L+NAA0.025 mg/L 中，結(jié)果表明，30 d 后，直徑從0.3 cm 增加到1.2 cm，重量從 0.1 g 增加到 1.7 g。其中第20～30天較前一階段增加明顯，增長幅度較大(表5)。說明愈傷組織在接種第20～30天生長很旺盛，擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)選擇在此時間段之后。

表5 接種30 d愈傷組織的變化

當(dāng)愈傷組織放置時間超過40 d時，即使沒有加入生根激素IAA，在其表面也會出現(xiàn)透明的根狀物(圖2)。

2.3 芍藥莖尖愈傷組織誘導(dǎo)擴(kuò)大培養(yǎng) 以芽基部愈傷組織為試驗(yàn)材料，選用MS為基本培養(yǎng)基，在不同濃度的BA、NAA中組合，分別在第10、20、30天觀察記載生長情況(表6)。結(jié)果表明，14種培養(yǎng)基均能完成擴(kuò)大培養(yǎng)，但生長狀況在20 d左右時存在一定差異，隨激素濃度的增加愈傷組織逐漸增多，到達(dá)一定程度時，有下降趨勢;在只加BA、不加NAA的情形下，30 d后愈傷組織有明顯的死亡現(xiàn)象。G11、G12培養(yǎng)基上愈傷組織增殖能力強(qiáng)，愈傷組織生長量大，適合作為誘導(dǎo)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

表6 愈傷組織在不同激素配比時的生長情況

3 討論

亳芍在組培苗培養(yǎng)過程中很容易受到污染，如培養(yǎng)基、超凈工作臺及容器等消毒過程不徹底、外植體帶菌、工作人員操作不規(guī)范等［6］。但最主要的原因是芍藥的地下嫩芽直接與土壤接觸，且有多層鱗片包裹，容易滋生一些菌類［7］。主要是細(xì)菌和真菌，細(xì)菌在接種2 d左右即可被發(fā)現(xiàn);真菌在接種7 d左右才出現(xiàn)癥狀。因此，芽的選擇和消毒尤為重要，在實(shí)際操作中一定要認(rèn)真對待。

芍藥為多年生草本植物，次生代謝旺盛，地下嫩芽內(nèi)含有較多的酚類化合物，組織培養(yǎng)過程中外植體極易褐化［8］，這些褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中不斷擴(kuò)散，抑制其他酶的活性，毒害培養(yǎng)材料，嚴(yán)重影響組培苗的成活率、擴(kuò)繁率［9－10］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，地下嫩芽在基質(zhì)中放置一段時間后能夠有效地降低褐化率，但放置時間太久，會增加污染，這就形成矛盾。如何調(diào)節(jié)這一矛盾，還需要進(jìn)一步研究。

針對如何把愈傷組織誘導(dǎo)成苗的問題，國內(nèi)外專家學(xué)者進(jìn)行大量研究，目前還沒有一個行之有效的解決辦法［11－12］。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)愈傷組織放置時間超過40 d時，即使沒有加入生根激素IAA，其表面也會出現(xiàn)透明的根狀物，具體原因有待進(jìn)一步研究。

［1］馬宗新，馬同富，孟冬青.亳芍莖尖組織培養(yǎng)的研究［J］.中國野生植物資源，2010(6):63－66.

［2］魏志華，王新民，喬卿梅，等.亳芍藥材適宜產(chǎn)區(qū)區(qū)劃研究［J］.北方園藝，2011(11):170－172.

［3］吳紅娟，于曉南.國內(nèi)外芍藥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(2):617－619.

［4］張慶瑞，孫建洲，任凝輝，等.芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(4):88－90.

［5］董永義，宋旭，郭園.觀賞芍藥組織培養(yǎng)研究［J］.林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2009(5):66.

［6］曲文靜，李青，劉燕.芍藥組織培養(yǎng)中地下芽污染的克服［J］.植物研究，2014(4):524－528.

［7］王吉鳳，李青，包欣.芍藥組織培養(yǎng)中污染現(xiàn)象的克服［J］.植物研究，2012(1):84－90.

［8］曲文靜.芍藥組織培養(yǎng)及褐化研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2014.

［9］王瑤.兩種芍藥愈傷組織的誘導(dǎo)及褐化抑制的研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2009.

［10］王瑤，岳樺.芍藥屬植物組織培養(yǎng)中褐化問題的研究進(jìn)展［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):159－160.

［11］薛銀芳，趙大球，周春華，等.芍藥組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2012(4):167－170.

［12］吳紅娟.芍藥品種地下芽誘導(dǎo)及愈傷組織培養(yǎng)研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2011.