3個芍藥品種對低溫的生理響應(yīng)及抗寒性評價

王 琪，于曉南

(1.天津城建大學建筑學院，天津300384;2.北京林業(yè)大學園林學院，北京100083;3.國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京100083)

芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)為芍藥科芍藥屬的多年生宿根草本植物，是我國的傳統(tǒng)名花，其品種多樣，花色各異，在寒冷地區(qū)的園林應(yīng)用中具有良好前景。

目前，關(guān)于芍藥屬植物抗寒性方面的研究多集中于牡丹組，而對芍藥的抗寒生理研究存在大量空白。金研銘等［1］對由菏澤引種至沈陽的7個牡丹品種進行抗寒性分析，認為電導(dǎo)法、牡丹體內(nèi)的束縛水含量及束縛水/自由水比值都能很好地鑒別不同品種的抗寒性。岳樺等［2］對引入黑龍江地區(qū)的10個紫斑牡丹品種在自然越冬期間的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量等生理生化指標進行研究，發(fā)現(xiàn)10個品種經(jīng)過低溫鍛煉后，丙二醛含量和可溶性糖含量呈不同程度的增加。鞠志新［3］以牡丹組3個品種群的12個品種為試材進行自然越冬和人工模擬低溫脅迫試驗，發(fā)現(xiàn)越冬期間枝條的脯氨酸含量、可溶性多糖含量、生長期葉片膜透性(相對電導(dǎo)率)可以作為牡丹抗寒性的參考指標。

以3個芍藥品種的地下芽與根為試材，筆者測定了不同低溫條件下它們的相對電導(dǎo)率、丙二醛等生理指標，利用主成分分析和隸屬函數(shù)法對3個芍藥品種的抗寒性進行排序和科學評價，為寒冷地區(qū)引種和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選用北京市小湯山國家花卉工程技術(shù)研究中心苗圃自2009年引種栽培以來生長正常的3個芍藥品種，即‘粉玉奴’、‘Monsieur Jules Elie’和‘Pink Hawaiian Coral’。在2011年10月，將已去除地上部分的各品種芍藥從原苗圃中挖出并清洗、分株，每株有5～8個強壯的地下芽，并將根修剪至15～20 cm長，去除小根、爛根等。選擇生長一致的芍藥，每個品種30株，種植于小湯山苗圃的同一地塊中，種植深度(坑深)在25～30 cm間。各植株在自然條件下冷藏至12月中旬(日平均氣溫穩(wěn)定在0℃左右)。每個品種隨機選擇9株，且小心挖出，從每株芍藥上采集3個地下芽(自芽的根部切下)，另外自根尖起切取最大直徑在1.5 cm左右、長5 cm的根，每株采取3條根，采后用錫箔紙分別包封好，立即回到實驗室進行處理。用流水將地下芽和根沖洗干凈后，再用去離子水漂洗3遍，并用濾紙吸干水分。每個品種隨機選擇21個地下芽和21條根，將各品種的試驗材料均分成7份后分別放入自封塑料袋中進行不同溫度的低溫脅迫處理。

1.2 試驗設(shè)計與方法 降溫儀器選擇奧地利SY-LAB公司生產(chǎn)的IceCube 14S型號程控降溫儀。以儀器內(nèi)部溫度4℃為起始，將試驗材料放入儀器。以0.02℃/min的速度下降，下降到0℃后保持5 h，然后每個品種取出1份;仍以0.02℃/min的速度降溫，下降到－6℃后保持5 h;每個品種再各取出1份，以此類推。試驗設(shè)置處理溫度梯度為0、－6、－12、－18、－24、－30、－36 ℃。在取出的試驗材料中，將各品種的地下芽分別放入4℃冰箱中解凍8 h后再取出，用于測定相對電導(dǎo)率;將根貯藏于液氮中，用于測定丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、SOD活性。

1.3 指標測定與計算

1.3.1 地下芽的質(zhì)膜相對透性測定。質(zhì)膜相對透性一般采用電導(dǎo)率法測定。電導(dǎo)率法作為鑒定植物抗寒性的主要方法之一，其用于根系測定時誤差往往較大［4］。芍藥不同于同科的牡丹等木本植物，在自然環(huán)境下越冬時只存留肉質(zhì)根和地下芽兩部分。芍藥的地下芽與其第2年的生長息息相關(guān)，并且受年齡、切片厚度等的影響較小。因此，該試驗采用地下芽進行相對電導(dǎo)率的測定。

從4℃冰箱中取出各芍藥品種的地下芽，分別將芽層層剝開，棄掉芽根部的附屬物和最外層鱗片，用濾紙擦干、切碎混勻后測定相對電導(dǎo)率［5］。

1.3.2 根的生理指標測定。芍藥根的丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定;可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定;脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G－250染色法測定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法測定［5－6］。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS18.0軟件進行3個芍藥品種抗寒生理指標平均值、標準差、各品種間統(tǒng)計學差異的計算以及各指標的相關(guān)性分析、主成分分析。利用隸屬函數(shù)法對3個芍藥品種的抗寒性進行綜合評價［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下地下芽的相對電導(dǎo)率變化 由表1可知，隨著溫度的下降，除了‘Pink Hawaiian Coral’地下芽的相對電導(dǎo)率以－6℃為轉(zhuǎn)折點呈現(xiàn)先小幅下降再升高，其他2個品種的相對電導(dǎo)率都一直呈升高的趨勢，并且從低溫脅迫開始，各品種的相對電導(dǎo)率變化逐漸加快，而隨著溫度的進一步降低，相對電導(dǎo)率的變化逐漸變緩，差異也逐漸不顯著。這與絕大多數(shù)植物在低溫脅迫條件下相對電導(dǎo)率所呈現(xiàn)的“S”型曲線趨于一致。

表1 低溫脅迫下3個芍藥品種地下芽的相對電導(dǎo)率%

2.2 低溫脅迫下根的生理變化 丙二醛作為細胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，被認為可以反映植物在冷應(yīng)激條件下的生理狀態(tài)。由圖1可知，隨著溫度的下降，‘粉玉奴’與‘Pink Hawaiian Coral’丙二醛含量都呈先增加再減少然后增加的變化趨勢，而‘Monsieur Jules Elie’則呈現(xiàn)“M”型的雙峰現(xiàn)象。除‘Monsieur Jules Elie’的丙二醛含量在－24℃達到最高值外，其他2個品種則都在－36℃達到峰值。

由圖2可知，隨著溫度的下降，3個芍藥品種根的可溶性糖含量變化較復(fù)雜，但是總體上都呈增加的趨勢。可溶性糖的積累對植物抗寒有重要作用，由此可知‘Monsieur Jules Elie’的抗寒能力相對較強。

脯氨酸的積累有助于增強植物的抗性。由圖3可知，3個芍藥品種根的脯氨酸含量在0～－18℃的降溫過程中都有所下降。隨著溫度下降到－30～－36℃，除‘Pink Hawaiian Coral’外，其他2個品種的脯氨酸含量都有所上升，但與0℃時相比仍然較低。

由圖4可知，‘Monsieur Jules Elie’可溶性蛋白含量以－6℃為轉(zhuǎn)折點呈現(xiàn)出先減少再增加的趨勢，‘粉玉奴’和‘Pink Hawaiian Coral’的可溶性蛋白含量則隨溫度的下降呈先升高再降低然后升高的趨勢。盡管3個品種的可溶性蛋白含量變化表現(xiàn)不一，但經(jīng)過低溫脅迫后均有所增加。

超氧化物歧化酶一直被認為是植物保護膜結(jié)構(gòu)的主要抗氧化劑之一，其活性的提高可以減少逆境對植物的傷害。由圖5可知，3個芍藥品種根的超氧化物歧化酶活性均隨著溫度的下降而呈先升高再降低然后升高的趨勢，并且均在－12℃達到各自的超氧化物歧化酶活性最高值。

2.3 不同芍藥品種的抗寒性綜合評價 一些研究已經(jīng)證實，相對電導(dǎo)率與植物的抗寒性呈相關(guān)性。當植物在經(jīng)受低溫脅迫時，植物的抗寒性越差，其相對電導(dǎo)率越高［8－10］。因此，首先通過對不同低溫下6個抗寒指標的相關(guān)性進行分析，再將與相對電導(dǎo)率在0.05水平和0.01水平相關(guān)的指標提取出來用于主成分分析，最后利用隸屬函數(shù)法對3個芍藥品種的抗寒性進行綜合評價。

2.3.1 抗寒指標的相關(guān)性分析。對3個芍藥品種的各項抗寒生理指標進行簡單相關(guān)分析。由表2可知，相對電導(dǎo)率與丙二醛含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均呈顯著正相關(guān)(P≤0.01)，與脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性則呈顯著負相關(guān)(P≤0.01);其他指標間也呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。由此可見，各指標間所提供的信息會有一定的重疊和疏漏，用多個生理指標進行抗寒性綜合評價是必要的。

表2 3個芍藥品種的抗寒指標相關(guān)性分析

2.3.2 抗寒指標權(quán)重的確定。根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果，對與相對電導(dǎo)率極顯著相關(guān)的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性5個生理指標進行主成分分析。根據(jù)表3中各指標的貢獻率確定權(quán)重，結(jié)果見表4。

表3 3個芍藥品種抗寒性指標的特征根及相應(yīng)貢獻率

2.3.3 抗寒指標的隸屬度及綜合指數(shù)值。根據(jù)3個芍藥品種抗寒性相關(guān)指標的隸屬度值(表5)，再對各指標進行合成，計算出3個芍藥品種的抗寒性綜合指數(shù)(表6)。根據(jù)表中抗寒性綜合指數(shù)的大小，得出3個芍藥品種的抗寒性強弱排序為‘Monsieur Jules Elie’＞‘粉玉奴’＞‘Pink Hawaiian Coral’。

表4 3個芍藥品種抗寒性指標的負荷量和權(quán)重

3 結(jié)論與討論

研究表明，低溫脅迫引發(fā)了芍藥體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)。以3個芍藥品種地下芽的相對電導(dǎo)率與根的5個生理指標之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，通過提取相關(guān)性較強的指標進行主成分分析，結(jié)合隸屬函數(shù)法，最終對3個芍藥品種的抗寒性進行比較。根據(jù)綜合指數(shù)，可知‘Monsieur Jules Elie’抗寒性最強，‘粉玉奴’次之，‘Pink Hawaiian Coral’最弱。

表5 3個芍藥品種抗寒性指標的隸屬度值

‘Pink Hawaiian Coral’地下芽的相對電導(dǎo)率從0℃到－30℃幾乎始終與其他2個品種有顯著差異(P≤0.05)，并且在－24℃時率先達到50%，可以推測其抗寒能力比其他2個品種更弱。在冷馴化過程中一些植物相容性物質(zhì)的積累被認為是其自身的一個低溫保護機制［11－12］。丙二醛、可溶性碳水化合物、蛋白質(zhì)和游離脯氨酸可能參與降低細胞液冰點、預(yù)防由凍害引發(fā)細胞脫水所造成的質(zhì)壁分離等活動［13－14］。研究還表明，3個芍藥品種根的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量隨著溫度的降低大致呈增加趨勢，其中各芍藥品種根的可溶性蛋白含量變化不一致。這與任麗［15］對4個牡丹品種根的研究結(jié)果相一致，說明芍藥屬植物肉質(zhì)根的可溶性蛋白含量隨溫度降低的變化規(guī)律不明顯。脯氨酸含量則與大部分植物抗寒性結(jié)果不同。研究表明，脯氨酸含量與植物體內(nèi)溶液的滲透勢密切相關(guān)［16］。額外產(chǎn)生的脯氨酸可以提高植物的抗?jié)B透脅迫［17］，但滲透調(diào)節(jié)并不只依賴一種物質(zhì)完成。除了脯氨酸，它還可能涉及其他有機相容物質(zhì)和諸如K+一類的無機離子［18］。與在植物體的其他器官作用相比，該機制在根的作用更加復(fù)雜。艾琳等［19］就發(fā)現(xiàn)5個葡萄品種根系的脯氨酸含量隨溫度的降低而下降。芍藥具有變態(tài)的肉質(zhì)根，從0℃至－18℃的各芍藥品種根的脯氨酸含量下降很可能是由各種原因綜合造成的。由于迄今為止人們對芍藥根的生理生化研究較少，這種現(xiàn)象的具體作用機制還有待進一步研究。一般認為，通過增加SOD活性可以加強保護細胞膜結(jié)構(gòu)的作用。試驗中的‘Pink Hawaiian Coral’和‘粉玉奴’的SOD活性一直較低，可以推測出二者的抗氧化系統(tǒng)較弱，抵御脅迫能力較差。

表6 3個芍藥品種抗寒性綜合指數(shù)和排名

前人的研究結(jié)果表明，從國外引種的芍藥切花品種(包括試驗中的‘Monsieur Jules Elie’和‘Pink Hawaiian Coral’)在北京的氣候條件下均可以正常生長、開花，并且保持較高的觀賞價值［20－21］。孫菊芳等［22］從美國引種栽培 13個芍藥與牡丹的組間雜種，發(fā)現(xiàn)它們可以在北京的氣候條件下正常生長。但是，研究中作為組內(nèi)亞組間雜種后代品種的‘Pink Hawaiian Coral’是3個品種中抗寒性最差的，其親本為Paeonia lactiflora‘Charlie＇s White’× P.peregrina‘Otto Froebel’，其中P.peregrina主要分布于歐洲東部和土耳其，比中國芍藥分布的氣候帶偏南。這可能是其雜交后代不如中國芍藥品種群耐寒的原因之一。另外，盡管雜種優(yōu)勢是影響植物抗性的一個重要因素，但抗寒性還與植物遺傳性、環(huán)境作用、植物株齡等多種因素有關(guān)。

［1］金研銘，徐惠風，李亞東，等.牡丹引種及其抗寒性的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學學報，1999，21(2):37 －39.

［2］岳樺，李欣，任麗，等.不同紫斑牡丹品種抗寒性差異分析［J］.東北林業(yè)大學學報，2009，37(5):62 －63.

［3］鞠志新.東北地區(qū)牡丹生態(tài)適應(yīng)性及抗寒性研究［D］.北京:北京林業(yè)大學，2011.

［4］李丙智，文建雷，張建平，等.電導(dǎo)法測定葡萄根系抗寒性方法的探討［J］.西北林學院學報，1993，8(3):105 －108.

［5］孔祥生，易現(xiàn)峰.植物生理學實驗技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［6］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［7］王琪，于曉南.3種彩葉樹對低溫的生理響應(yīng)及抗寒性評價［J］.北京林業(yè)大學學報，2013，35(5):104 －109.

［8］董麗，黃亦工，賈麥娥，等.北京園林主要常綠闊葉植物抗凍性及其測定方法［J］.北京林業(yè)大學學報，2002，24(3):70 －73.

［9］崔紅，于晶，高秀芹，等.3個紫斑牡丹品種的抗寒生理特性研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40(7):24 －27.

［10］趙雪梅，成仿云，唐立紅，等.赤峰地區(qū)紫斑牡丹的引種與抗寒性研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2011，33(2):84 －90.

［11］ALBERDI M，CORCUERA L J.Cold acclimation in plants［J］.Phytochemistry，1991，30:3177 －3184.

［12］LIVINGSTON D P.The second phase of cold hardening:freezing tolerance and fructan isomer changes in winter cereal crowns［J］.Crop science，1996，36:1568 －1573.

［13］SAKAI A，LARCHER W.Frost survival of plants:Responses and adaptation to freezing stress［M］.Berlin:Springer Verlag，1987.

［14］SANTARIUS K A.Freezing of isolated thylakoid membranes in complex media.VIII.Differential cryoprotection by sucrose，proline and glycerol［J］.Physiologia plantarum，1992，84:87 －93.

［15］任麗.十種中原牡丹引種哈爾濱地區(qū)抗寒性研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學，2009.

［16］CHU T M，ASPINALL D，PALEG L G.Stress metabolism.Ⅵ.Temperature stress and the accumulation of proline in barley and radish［J］.Australian journal of plant physiology，1973，26:319 －327.

［17］KAVI K P B，HONG Z，MIAO G H，et al.Overexpression of 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants［J］.Plant physiology，1995，108:1387 －1394.

［18］王寶山，趙可夫，鄒琦.作物耐鹽機理研究進展及提高作物抗鹽性的對策［J］.植物學通報，1997，14(S1):25 －30.

［19］艾琳，張萍，胡志成.低溫脅迫對葡萄根系膜系統(tǒng)和可溶性糖及脯氨酸含量的影響［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27(4):47 －50.

［20］姚苗笛.芍藥切花品種引種及繁殖研究［D］.北京:北京林業(yè)大學，2009.

［21］于曉南，宋煥芝，王琪.北美新芍藥品種引種適應(yīng)性初報［J］.林業(yè)實用技術(shù)，2011(12):50－51.

［22］孫菊芳，成仿云.芍藥與牡丹組間雜種引種栽培初報［J］.中國園林，2007(5):51－54.