力竭運動對大鼠骨骼肌VEGF、bFGF、TGF-β1的影響?

劉秀娟

（南京體育學院運動健康科學系，江蘇 南京 210014）

力竭運動對大鼠骨骼肌VEGF、bFGF、TGF-β1的影響?

劉秀娟

（南京體育學院運動健康科學系，江蘇 南京 210014）

目的：探討力竭運動對大鼠骨骼肌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）的影響，分析力竭運動對骨骼肌運動機能的影響，為運動訓練中肌肉力量的訓練及損傷修復提供理論依據(jù)。方法：8周齡雄性SD大鼠24只，隨機分為2組，安靜對照組和力竭運動組，每組12只，力竭運動組進行急性力竭運動后，取腓腸肌，real time PCR檢測VEGF、bFGF和TGF-β1的表達。結(jié)果：力竭運動顯著提高了大鼠腓腸肌VEGF mRNA的表達（P ＜ 0.05），極顯著提高bFGF mRNA的表達量（P ＜ 0.01），但力竭運動對TGF-β1的基因表達無顯著性影響。結(jié)論：(1)力竭運動顯著提高了大鼠腓腸肌VEGF、bFGF mRNA的表達，提示力竭運動可能通過上調(diào)VEGF、bFGF的表達量，增加骨骼肌毛細血管的密度，從而提高骨骼肌的運動機能。(2)力竭運動極顯著上調(diào)bFGF的表達，提示力竭運動可能通過上調(diào)bFGF的表達，促進運動時骨骼肌的損傷修復。

力竭運動；骨骼??；VEGF；bFGF； TGF-β1

近年來，越來越多的學者開始關(guān)注VEGF、bFGF在肌肉毛細血管新生中的作用，尤其是在運動導致毛細血管新生的過程中，這些細胞生長因子的反應更是敏感。研究表明，VEGF是一種很強的誘導血管新生的因子，可以促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，誘導毛細血管的官腔形成[1,2]。bFGF是內(nèi)皮細胞的促生長因子，與VEGF共同發(fā)揮強大的促進血管新生的作用。bFGF可以增加VEGF基因的啟動子區(qū)SP-1的表達，進而促進VEGF的產(chǎn)生，同時還能通過誘導細胞內(nèi)的VEGF受體2來增強VEGF的表達[3,4]。并且bFGF在正常的生理以及病理過程中參與了生長發(fā)育和組織損傷修復的過程。實驗表明，細胞因子與骨骼肌的損傷及增殖有著十分鐘緊密的關(guān)系。研究證實TGF-β1和bFGF可以促進細胞增殖及分化，在骨骼肌損傷修復過程中起非常重要的作用。有研究表明，bFGF可以促進TGF-β1的分泌，進而促進骨骼肌損傷后的修復[5]。

本實驗以SD大鼠為研究對象，建立力竭游泳運動模型，測定腓腸肌中的VEGF、bFGF、TGF-β1的表達，探討大鼠在急性力竭運動后VEGF、bFGF、TGF-β基因的變化，探索力竭運動對骨骼肌運動機能及損傷修復的影響機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物分組

健康的雄性SD大鼠共24只，8周齡。隨機分為2組，安靜對照組，力竭運動組，每組12只。自然飼養(yǎng)，溫度為25±2℃，自由飲水，采食。

1.1.1 實驗條件

實驗組大鼠正式實驗前，進行為期一周的適應性游泳運動，每天一次，每次半小時。大鼠游泳運動在120ⅹ60ⅹ100cm的水池中進行，水深為60cm，尾部負重為1.8%BW（預實驗確定力竭游泳負荷），水溫控制在30℃ ± 2℃。在游泳過程中發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)3次沉入水底超過10s不能回到水面；在水中亂竄，動作出現(xiàn)失調(diào)，撈出后無法完成翻正反射，視為力竭。

1.1.2 大鼠體重

表1 大鼠體重變化（BW）（±SD）

表1 大鼠體重變化（BW）（±SD）

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1.2.3 取樣

大鼠力竭后即刻斷頭，剝離腓腸肌，放入2 ml Eppendorf管中，置于液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，以備后期檢測。

1.3 實驗方法

表2 引物序列

腓腸肌總RNA用Trizol試劑盒提取。提取的總RNA用Nano Drop（ND-2000）測定總RNA濃度和純度（OD260/OD280= 1.8～2.0）。瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

根據(jù)RT試劑盒說明書對所有樣品的RNA進行RT，獲得各樣品RNA的cDNA（RT產(chǎn)物）。RT產(chǎn)物保存在-20°C用于PCR檢測。

ACTIN和目的基因根據(jù)GenBank上大鼠的相關(guān) cDNA序列設(shè)計，由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

試驗采用實時熒光定量PCR（Real time quantitative PCR）對目的基因的表達進行相對定量，用2-ΔΔCT法對有效性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以相當于對照（Calibrator）的倍數(shù)做圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計

采用SPSS軟件（For Windows Version 17.0）統(tǒng)計分析，對所得數(shù)據(jù)采用獨立樣本T檢驗分析方法進行分析， P ＜ 0.05代表差異顯著，P ＜ 0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 力竭運動對腓腸肌VEGF表達的影響

如圖1所示，力竭運動顯著提高大鼠腓腸肌VEGF mRNA的水平。

圖1 力竭運動對腓腸肌VEGF表達的影響

2.2 力竭運動對腓腸肌bFGF表達的影響

如圖2所示，力竭運動極顯著地提高了大鼠腓腸肌bFGF mRNA的表達。

圖2 力竭運動對腓腸肌bFGF表達的影響

2.3 力竭運動對腓腸肌TGF-β1表達的影響

由圖3可知，力竭運動對腓腸肌TGF-β1的表達并無顯著性影響。

圖3 力竭運動對腓腸肌TGF-β1表達的影響

3 討論

3.1 力竭運動對大鼠VEGF表達的影響

研究表明，VEGF是一種缺氧反應基因，其表達受氧濃度、癌基因及一些細胞因子的影響[6]。低氧使VEGF基因表達升高具有重要的病理及臨床意義[7, 8]。運動作為一種外界刺激可以影響機體不同組織VEGF的表達。宋凱等研究發(fā)現(xiàn)低氧、運動以及低氧運動都能使血清VEGF含量減少，同時使心肌VEGF基因表達均升高[9]。宋海霞等研究報道8周不同強度的運動均顯著增加VEGF的表達[10]。畢業(yè)等在探索不同強度耐力訓練對骨骼肌VEGF的影響中，指出不同強度的運動訓練對不同類型骨骼肌VEGF基因表達影響并不一致[11]。陸彩鳳等對一次性力竭離心運動對骨骼肌VEGF的表達變化發(fā)現(xiàn)一次力竭性離心運動后大鼠腓腸肌VEGF的表達增加，2h達到峰值，3h、4h、1天、3天時保持高表達，5天和10天時基本恢復至基礎(chǔ)水平[12]。本實驗中，力竭運動后大鼠腓腸肌VEGF表達顯著上調(diào)，提示力竭運動對VEGF有促進作用。這與大多數(shù)研究報道的結(jié)果一致。國外有研究證實，游泳引起VEGF表達增加，VEGF的表達在運動后即刻升高，并且在運動過程中逐漸增加，運動后12天毛細血管密度增加[13]。Birot等人的實驗表明，雌性Wistar大鼠進行下坡跑運動，跖肌中的VEGF的表達升高90%，VEGF的蛋白含量則增加72%[14]。

3.2 力竭運動對大鼠腓腸肌bFGF表達的影響

分子生物學的發(fā)展讓人們發(fā)現(xiàn)bFGF有促進血管形成的作用。不管是體內(nèi)還是體外的血管內(nèi)皮細胞都可以在bFGF的誘導作用下形成新的小血管。研究表明，運動對bFGF表達有顯著影響。Markolefrt等人的研究表明，訓練8周后，bFGFmRNA表達水平有顯著增加[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，急性力竭運動極顯著上調(diào)了大鼠腓腸肌bFGF的表達，這與運動能增加bFGF表達的研究結(jié)果相符。

3.3 力竭運動對大鼠腓腸肌TGF-β1表達的影響

轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1是一種多功能的生長因子，它可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和分化等，并且在維持組織動態(tài)平衡中也起重要作用。TGF-β1可以促進細胞外組織沉積和纖維化形成，低濃度的TGF-β1可以增加細胞外基質(zhì)的合成，研究報道TGF-β1高表達是心肌組織纖維化的主要調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動對大鼠腓腸肌TGF-β1的表達并無顯著性影響，可能是TGF-β1在檢測的時間點變化不明顯，抑或其對本實驗刺激不敏感所致。

3.4 力竭運動對大鼠腓腸損傷修復的影響

運動性骨骼肌損傷是一種高強度和長時間運動后發(fā)生的損傷。運動性骨骼肌損傷的修復是一個細胞和分子水平上復合性、程序性的過程。多年來人們認為骨骼肌損傷后主要是瘢痕修復，且會影響運動能力。但近幾年的一些研究顯示，骨骼肌損傷后大量的細胞因子會再生。有研究顯示bFGFmRNA在運動性骨骼肌損傷中有一定影響，發(fā)現(xiàn)正常訓練組的bFGF mRNA在第3天開始升高，第8-12天達到頂峰，而在一周力竭組的bFGFmRNA于第2天就有較高水平[16]。TGF-β1作為一種多功能的細胞生長因子，在骨骼肌損傷修復方面有著不可忽視的影響。但是本研究結(jié)果顯示，力竭運動對TGF-β1并無顯著性影響。眾所周知，運動性骨骼肌損傷是一種高強度和長時間運動后發(fā)生的損傷。本實驗采取的急性力竭實驗滿足了長時間的運動，但是強度方面的把控可能沒有那么嚴格，所以無法保證力竭運動后的大鼠產(chǎn)生骨骼肌損傷。本實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示bFGF基因表達極顯著上調(diào)，但TGF-β的表達沒有顯著差異，另外，由于檢測指標上的缺憾，所以無法確定力竭運動后骨骼肌損傷及修復程度。

4 結(jié)論

4.1 力竭運動顯著提高了大鼠腓腸肌VEGF、bFGF mRNA的表達，提示力竭運動可能通過上調(diào)VEGF、bFGF的表達量，增加骨骼肌毛細血管的密度，從而提高骨骼肌的運動機能。4.2 力竭運動極顯著上調(diào)bFGF的表達，提示力竭運動可能通過上調(diào)bFGF的表達，促進運動時骨骼肌的損傷修復。

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Effects of Exhaustive Exercise on VEGF, bFGF and TGF-1 in Skeletal Muscle of Rats

LIU Xiu-Juan
(Nanjing Institute of PE, Nanjing 210014, Jiangsu, China)

[Objective]: To investigate the effect of exhaustive exercise on endothelial growth factor vascular (VEGF), basic fibroblast growth factor bFGF and transforming growth factor-β1 (TGF-β1), and analyze the effect of exhaustive exercise on skeletal muscle movement, and to provide theoretical basis for the muscle strength training and injury repair.[Methods]: tweenty-four healthy male SD rats, 8 weeks old.They were randomly divided into 2 groups, quiet control group and exhaustive exercise group.After acute exhaustive exercise, we collected the gastrocnemius muscle, using the method of real-time fluorescence quantitative PCR to detect the expression of VEGF, bFGF and TGF-β1.[Results]: the expressions of mRNA VEGF (P ＜ 0.05) and mRNA bFGF (P ＜ 0.01) were significantly increased in exhaustive exercise group, but the expression of TGF-β1 was not significantly affected by exhaustive exercise.[Conclusions]: 1)The expressions of bFGF and mRNA VEGF in rat gastrocnemius muscle were significantly improved by exhaustive exercise.The results indicated that the exhaustive exercise may increase the density of blood capillary by increasing the expressions of VEGF and bFGF, so as to improve the motor function of skeletal muscle.2)The expression of bFGF was significantly up-regulated by exhaustive exercise, which suggested that exhaustive exercise may promote the repair of skeletal muscle by up regulating the expression of bFGF.

exhaustive exercise; skeletal muscle; VEGF; bFGF; TGF-β1

劉秀娟（1984-），山東諸城人，博士，講師，研究方向：運動生物化學。