液相制備油茶葉提取物組分及其結(jié)構(gòu)鑒定

曹清明，鐘海雁，鄔靖宇，包莉圓，孫亞娟

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室；b.食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

液相制備油茶葉提取物組分及其結(jié)構(gòu)鑒定

曹清明a,b，鐘海雁a,b，鄔靖宇b，包莉圓b，孫亞娟b

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室；b.食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

為了綜合開發(fā)利用油茶資源，對油茶葉提取物的組分進行了制備和鑒定。將經(jīng)過大孔樹脂和柱分離純化收集的組分II、III和VIII等油茶葉提取物3個組分進行了HPLC制備，得到了8個純度較高的化合物，通過薄層顯色、高清晰質(zhì)譜和NMR，鑒定了其中4個化合物為：二氫白藜蘆醇（1）、槲皮素（3）、槲皮素-3-鼠李糖苷（6）、1-(3′, 5′-二甲氧基)苯基2-[4″-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷（8），其中槲皮素和槲皮素-3-鼠李糖苷是油茶中最常見的2個黃酮類物質(zhì)，1-(3′,5′-二甲氧基)苯基2-[4′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷為第2次報道，但提取率遠高于首次報道，二氫白藜蘆醇在山茶屬植物中屬首次報道。

液相色譜；制備；高清晰質(zhì)譜；結(jié)構(gòu)鑒定；核磁

茶油不飽和脂肪酸含量接近90%[1-4]，其脂肪酸組成與橄欖油極為相似，在許多品質(zhì)指標(biāo)上也較為接近，隨著人們追求健康綠色需求的增大，具有中國特色的茶油越來越受到人們的重視。為了提高油茶的利用率，其副產(chǎn)物活性成分的研究也成為熱點，主要側(cè)重于油茶籽[5-7]、油茶粕[8-10]、茶油品質(zhì)[11-13]、油茶種質(zhì)資源[14-15]、油茶果皮[16-19]等方面，對油茶葉的研究報道相對較少。

研究表明，油茶葉含有脂肪、蛋白質(zhì)、還原糖、氨基酸、茶皂素[20]、葉綠素[21]以及黃酮類化合物[22]等成分。油茶葉中提取物具有多種功效作用，包括抗氧化[22]、抗菌、降血脂和抗癌等功效，民間用來治療無名腫毒、犬咬及火燒成瘡等疾病[23]。

分離純化可簡化樣品[24]，快速獲得純度較高的單體化合物。油茶葉成分復(fù)雜，將其乙醇提取物進行大孔樹脂粗分離[25]和柱層析法分離[26]，有利于對油茶葉組成成分的提取，也有利于對其成分的功能性質(zhì)進行探究。

制備型高效液相色譜法可以是一種特殊的柱層析方法，攜帶混合物的流動相經(jīng)過固定相時，由于各物質(zhì)性質(zhì)的差異，在固定相上滯留的時間有長短之分，因而根據(jù)滯留時間的長短按先后順序在固定相中流出，從而達到分離效果[27]。本試驗中以油茶葉為材料，在D-101大孔樹脂分離和硅膠柱層析分離純化樣品的基礎(chǔ)上，利用高效液相半制備純度較高的化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）新鮮油茶葉 采自湖南省天際嶺國家森林公園，由中南林業(yè)科技大學(xué)譚曉風(fēng)教授鑒定為普通油茶Camellia oleifera葉。

（2）試劑 甲醇，美國Fluka公司生產(chǎn)；乙醇，國藥集團生產(chǎn)；二氯甲烷，國藥集團生產(chǎn)；二甲基亞砜（DMSO），國藥集團生產(chǎn)；D-101大孔樹脂，天津富邦化工科技有限公司生產(chǎn)；硅膠層析用硅膠，青島海洋公司生產(chǎn)。

（3）儀器 分析用液相色譜儀為依利特高效液相色譜儀，配UV1201檢測器；分析色譜柱為Unitary C18 4.6 mm×250 mm，5 μm，浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)；制備色譜柱為C18，10 mm×250 mm，5 μm，浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)；創(chuàng)新通恒科技有限公司生產(chǎn)的LC3000型液相色譜儀（半制備液相色譜）；創(chuàng)新通恒科技有限公司生產(chǎn)的LC6000高效液相色譜儀（DAC制備色譜）。紫外可見分光光計（UV-6300），上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)；高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-205B），上海申勝儀器公司生產(chǎn)；恒溫水浴鍋，北京醫(yī)療電子儀器廠生產(chǎn)；超聲波清洗器（JK-500B），合肥金尼克機械制造有限公司生產(chǎn)；氮吹儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司生產(chǎn)； UV-6300掃描型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)；安捷倫LC-MS組成系統(tǒng)，Agilent 1260安捷倫1260無限生物惰性四元泵（G5611A）；Agilent 1260高性能生物惰性自動進樣器（G5667A）；Agilent 1290無限柱溫箱（G1316C）；G1315D二極管陣列檢測器；Agilent 6530 QTOF 質(zhì)譜系統(tǒng)；超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀，AVANCE 400MHZ，瑞士Bruker公司生產(chǎn)。

1.2 試驗流程

粗細分離得到化合物的過程如圖1所示。

圖1 化合物制備流程Fig. 1 Process of compounds preparation

1.3 試驗方法

1.3.1 油茶葉50%乙醇提取物的制備

油茶干燥葉粉末20 kg，用50%乙醇按料液比1∶3加熱回流提取2次，每次提取2 h，過濾，減壓濃縮為濃縮前的1/2，得油茶葉提取液，備用。

1.3.2 高效液相半制備

（1）高純度化合物的制備 將硅膠制備的接收液用適量DMSO溶解，根據(jù)高效液相色譜譜圖的出峰時間收集制備單體化合物。

（2）化合物純度檢測 將制備的單體化合物，用液相色譜檢測，根據(jù)譜圖的峰面積判斷制備樣品的純度。色譜檢測條件：流動相A為甲醇，B為0.2%甲酸。洗脫梯度：50%甲醇0 min；50%甲醇15 min；80%甲醇0～25 min；85%甲醇25～35 min。進樣量5 μL，檢測波長254 nm，流速1 mL/min。

1.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定

對樣品成分進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters

色譜條件為：流動相A 0.2%甲酸溶液，流動相B甲醇。溶劑梯度為0～35 min內(nèi)流動相B由0%增至100%，流速為0.2 mL/min；進樣量5 μL；檢測波長254 nm。

NMR：核磁共振所有H譜均為400 MHz，所有13C譜均為100 MHz。核磁共振檢測條件：核磁共振一維和二維脈沖序列采用儀器的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)程序，1H-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加32次；13C-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加2 000次，H-H COSY、HSQC、HMBC這3種試驗采樣數(shù)據(jù)陣均為F2×F1＝2 048×256，零填充至2 048×1 024進行FT變換，窗函數(shù)處理譜圖。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜處理軟件：Agilent MassHunter Workstation Software，Version B.04.00，Build 4.0.479.0。 色 譜處理軟件：Agilent 1200 Chemstations軟件。利用質(zhì)譜分子式計算器對碎片離子峰進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC制備高純度化合物

2.1.1 組分II（7）中化合物的制備

圖2是組分II的液相色譜圖，分別制備1～5號峰，并對接收到的5段接收液進行純度檢驗。

圖2 組分II（7）液相色譜制備Fig. 2 HPLC preparation of part II (7)

由圖2可知，1號和2號雜質(zhì)含量較高，3、4、5號峰純度在90%以上，達到做結(jié)構(gòu)鑒定的要求。將這3個峰對應(yīng)的接收液濃縮稱重得到3個化合物：化合物1（3號峰）37 mg；化合物2（4號峰）6 mg；化合物3（5號峰）4 mg。經(jīng)計算可得，化合物1提取得率37 mg/kg，化合物2的提取得率6 mg/kg，化合物3提取得率4 mg/kg。

2.1.2 組分III（8）中化合物的制備

圖3是組分III的液相色譜圖，分別收集制備1～3號峰，并對接收到的3段接收液進行純度檢驗。

圖3 組分III（8）液相色譜制備Fig. 3 HPLC preparation of part III (8)

由圖3可知，1號和2號有單一色譜峰且峰形尖銳，由色譜峰面積計算純度在90%以上，而3號峰接收液中含有2個相連的明顯色譜峰，純度要求低于結(jié)構(gòu)鑒定水平。制備得到化合物4（1號峰）17 mg，化合物5（2號峰）11 mg。經(jīng)計算可得，化合物4的提取得率為17 mg/kg，化合物5的得率為11 mg/kg。

2.1.3 組分VIII（19～22）中化合物的制備

圖4是組分VIII的液相色譜圖，分別收集制備1～4號峰，并對接收到的4個化合物進行純度檢驗。

圖4 組分VIII（19～22）液相色譜制備Fig. 4 HPLC preparation of part III (19-22)

由圖4可知，1號峰代表的物質(zhì)雖然在低劑量的純度檢驗中僅有1個明顯峰，但是峰形較寬，純度不夠，2～4號峰代表的物質(zhì)檢測所得色譜峰只含有1個明顯色譜峰且色譜峰峰形尖銳，根據(jù)峰面積計算得到的純度均在90%以上，達到做結(jié)構(gòu)鑒定的要求。濃縮后得到化合物6（2號峰）4 mg；化合物7（3號峰）6 mg；化合物8（4號峰）200 mg，經(jīng)計算可得，化合物6的提取得率為4 mg/kg，化合物7的提取得率為6 mg/kg，化合物8的提取得率為200 mg/kg。

2.2 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

本試驗采用薄層顯色、高清質(zhì)譜和核磁共振法等方法，鑒定了從油茶葉中分離得到的4個化合物的結(jié)構(gòu)，另外4個樣品由于數(shù)量太少或不純等原因未能得到鑒定。

2.2.1 化合物1結(jié)構(gòu)解析

白色針狀結(jié)晶，溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，三氯化鐵反應(yīng)呈紫色，提示結(jié)構(gòu)為酚類化合物。HRESI-MS（Positive）給出m/z：231.102 4 [M+H]+，(Calcd for C14H14O3，231.101 6)。

在 1H-NMR 中，δ6.98（2H; m; 8.5 Hz） 與δ6.70（2H; m; 8.5 Hz）形成典型的對位取代苯的AA′BB′自旋系統(tǒng)；δ6.16（2H; d; 2.0 Hz）與δ6.12（1H;t; 2.0 Hz）形成典型的1,2,4-三取代苯AX2的自旋系統(tǒng)。在13C-NMR中，δ37.93和39.46為亞甲基碳信號，其余均為苯環(huán)的不飽和碳信號。將碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻[28]中報道的化合物2對照，基本一致，因此，可鑒定單體化合物為二氫白藜蘆醇，結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

圖5 二氫白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)式Fig. 5 Structural formula of dihydroresveratrol

2.2.2 化合物3結(jié)構(gòu)解析

黃色粉末，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性，Mg-HCl反應(yīng)呈陽性，提示為黃酮類化合物，EI-MS顯示其分子離子峰m/z：303.0494[M+H]+，(Calcd for C15H10O7，303.0499)。

13C NMR（100 MHz，CD3OD）中，δ177.356（C-3），165.597（C-7），162.507（C-5），158.245（C-9），148.774（C-1），148.036（C-4'），146.227（C-3'），137.250（C-2），124.161（C-1'），121.689（C-6'），116.245（C-5'），116.051（C-2'），104.527（C-4），99.267（C-6），94.432（C-8）；1H NMR（400 MHz， CD3OD）中δ7.7（1H, d, J=1.76 Hz, H-2'），δ7.6（1H, dd,J=8.4 Hz,H-6'），δ6.8（1H, d,J=8.5 Hz, H-5），δ6.3（1H, d,J=1.25 Hz, H-8），δ6.1（1H, d, J=1.51 Hz, H-6）。

綜上所述，可以推斷化合物3為槲皮素。

2.2.3 化合物6結(jié)構(gòu)解析

黃色針狀結(jié)晶（甲醇），溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，鹽酸鎂粉反應(yīng)顯陽性，三氧化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，Molish反應(yīng)呈陽性，提示結(jié)構(gòu)為黃酮苷類化合物。ESI-MS（Positive）給 出m/z：449.108 5[M+H]+，m/z303.050 4[M-Rha+H]+，(Calcd for C21H20O11，449.107 8)，顯示化合物1是由槲皮素苷元和1個鼠李糖基組成。

在1H-NMR中，可見2個苯環(huán)間位質(zhì)子信號δ6.20(1H, brs)和 δ6.36 (1H, brs)分別歸屬于 A 環(huán)的H-6和H-8；另有一組ABX偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號 δ6.92(1H, d,J= 8.2 Hz)，δ7.31(1H, d,J=8.2 Hz)和 δ7.34(1H, s)分別歸屬于B 環(huán)的 H-5'，H-6'和H-2'；δ5.35(1H, brs)為鼠李糖的端基質(zhì)子信號，δ0.95(1H, d,J=6.0 Hz)為鼠李糖的甲基質(zhì)子信號。在13C-NMR中，可見一組鼠李糖基碳信號δ105.90，73.26，71.89，72.00，72.13，17.63。 將碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻[22]中報道的化合物2以及文獻[29]中報道的化合物10對照，基本一致，因此，可鑒定單體化合物為槲皮素3-O-α-L-鼠李糖，結(jié)構(gòu)式如圖6所示。

圖6 槲皮素3-O-α-L-鼠李糖的結(jié)構(gòu)式Fig. 6 Structural formula of quercetin 3-O-α-L-rhamnoside

2.2.4 化合物8結(jié)構(gòu)解析

白色針狀結(jié)晶，溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，Molish反應(yīng)呈陽性，提示為糖苷類化合物。ESI-MS（Positive）給出m/z：531.223 1[M–2H2O+H]+，(Calcd for C28H38O12，531.223 5)，m/z259.133 1 [M–Rha–Glc+H]+，顯示單體是由 3,5-二甲氧基-4'-羥基-二苯乙烯和1個蕓香糖組成的二氫白藜蘆醇糖苷。

在1H-NMR中，δ7.15（2H; d; 8.5 Hz）與δ6.93（2H; d; 8.5 Hz）形成對位取代苯的AA′BB′自旋系統(tǒng)，δ6.38 （2H; d; 2.0 Hz）與 δ6.29（1H; t; 2.0Hz）形成1,2,4-三取代苯的AX2的自旋系統(tǒng)，δ3.68歸屬于2組等價的連氧甲基質(zhì)子；δ4.75(1H, d,J=7.5 Hz)為葡萄糖基的端基質(zhì)子信號，δ4.58 (1H, d,J=1.6 Hz)為鼠李糖基的端基質(zhì)子信號，δ1.13（3H;d; 6.5 Hz）為鼠李糖基甲基質(zhì)子信號。在13C-NMR中，可以觀察到2組糖基碳信號，分別歸屬于葡萄糖基和鼠李糖基，δ55.48為連氧甲基碳信號。將碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻[30]中報道的化合物3對照，基本一致。因此，可鑒定單體化合物為1-(3′,5′二甲氧基 )-苯基 -2-[4′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]-苯乙烷，結(jié)構(gòu)式如圖7所示。

圖7 1-(3′,5′二甲氧基 )-苯基 -2 -[4′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]-苯乙烷的結(jié)構(gòu)式Fig. 7 Structural formula of 1-(3′,5′-dimethoxy)-phenyl-2-[4′-O-β-D-glucopyranosyl (6→1)-O-α-L-rhamnopyranosyl]-phenylethane

3 結(jié) 論

高效液相色譜具有分離度高、靈敏度高、重復(fù)率好、分析快速等特點。高沸點不易揮發(fā)的、受熱易分解的極性活性成分、有機和無機離子化合物等都可以利用高效液相進行分離制備，該方法所得的化合物純度高。

對于油茶葉多酚化合物的深入研究，可以為油茶葉的利用打下理論基礎(chǔ)。試驗中對油茶葉提取物在大孔樹脂和柱層析純化分離的基礎(chǔ)上，用液相色譜對3個組分的12個峰進行制備，得到了8個純度90%以上的化合物。通過薄層顯色、高清晰質(zhì)譜和NMR，鑒定了其中4個化合物：二氫白藜蘆醇、槲皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、1-（3′,5′-二甲氧基）苯基 2-[4′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]-苯乙烷，其余4個樣品由于數(shù)量太少或者純度不夠未能得到鑒定。其中槲皮素和槲皮素-3-鼠李糖苷是油茶葉中常見的化合物，二氫白藜蘆醇屬于首次報道。

油茶樹在幼齡期進行修剪整形及每年春末夏初間打葉產(chǎn)生的大量油茶葉，若能合理利用可以大大提高油茶的經(jīng)濟效益?？傊?，油茶資源的深入研究，可以產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益和社會意義。

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Compounds and structure identification in extracts fromCamellia oleiferaleaves by HPLC preparation

CAO Qing-minga,b, ZHONG Hai-yana,b, WU Jing-yub, BAO Li-yuanb, SUN Ya-juanb
(a.Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Ministry of Education; b. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to comprehensively develop and utilizeCamellia oleiferaresources, compounds in extracts fromC. oleiferaleaves were separated and identified. Three extracted parts of II, III and VIII fromC. oleiferaleaves were separated, purified and collected by using macroporous resin and column chromatography, and eight high-purity compounds were achieved by HPLC preparation. Four compounds were identified by methods of TLC colouring, high resolution LC-MS, and NMR, including dihydroresveratrol (1), quercetin (3), quercetin 3-O-β-D-rhamnoside (6) and 1-(3′, 5′-dimethoxy) phenyl-2-[4″-O-β-D-glucopyranosyl (6 → 1)-O-α-L-rhamnopyranosyl]phenylethane (8). Among the four compounds, the compounds 3 and 6 were very popular flavonoids inC. oleifera, and this was the second time that the compounds 8 was reported, but the extraction rate was higher than that in the first report. This was the first time that dihydroresveratrol was reported inCamellia.

liquid chromatography; preparation; high resolution mass spectrum; structure identification; nuclear magnetic

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.012 http: //qks.csuft.edu.cn

2015-05-11

國家自科科學(xué)基金項目“高抗氧活性油茶生物酚組分的結(jié)構(gòu)表征及其作用機理研究”（31070612/C161103）。

曹清明，副教授，博士研究生。

鐘海雁，教授。E-mail：zhonghaiyan631210@126.com

曹清明,鐘海雁, 鄔靖宇,等.液相制備油茶葉提取物組分及其結(jié)構(gòu)鑒定[J].經(jīng)濟林研究,2015,33(3):68－74.

S609；S794.4

A

1003—8981(2015)03—0068—07

[本文編校：聞 麗]