大腸桿菌O157：H7量子點(diǎn)免疫層析試紙條的研制

袁列江 李萌立 王書源 楊夢(mèng)昕 李忠海

（1.湖南產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

在中國(guó)的食品中毒事件中，約一半由微生物引起，其中又以大腸桿菌引起的最多［1－4］。大腸桿菌 O157：H7型（Escherichia coliO157：H7）是一種腸道出血性大腸桿菌，是主要食源致病菌之一［5］。大腸桿菌O157：H7的致病性極強(qiáng)，有文獻(xiàn)［6］報(bào)道僅需100～200個(gè)細(xì)菌即可對(duì)人體產(chǎn)生中毒反應(yīng)。大腸桿菌O157：H7在全球頻繁發(fā)生，傳播范圍廣，致病性強(qiáng)，往往一爆發(fā)就會(huì)造成嚴(yán)重危害，因此引起了各國(guó)政府的普遍關(guān)注。2011年腸出血性大腸桿菌菌株（EHEC）在歐洲的傳播非常迅猛，有13個(gè)國(guó)家的2 400多人被感染，其中23人死亡［7］。中國(guó)也爆發(fā)過多次，1999年發(fā)生的大腸桿菌O157：H7中毒事件，對(duì)中國(guó)的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失［8］。

傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測(cè)方法為平板培養(yǎng)法，試驗(yàn)條件要求簡(jiǎn)單，但操作繁瑣，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。分子生物學(xué)方法靈敏度高，但在實(shí)際應(yīng)用中受試驗(yàn)儀器的制約［9－13］。免疫層析技術(shù)［14］是近年發(fā)展的一種快速檢測(cè)方法，其檢測(cè)簡(jiǎn)單迅速，每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間在5min，方便快捷、特異靈敏、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要設(shè)備支撐，是一種優(yōu)良的快速檢測(cè)技術(shù)。解泉源等［15］以熒光微球?yàn)闃?biāo)記物建立了大腸桿菌O157：H7熒光微球免疫層析試紙條，不借助檢測(cè)儀器條件下檢測(cè)限可達(dá)1.2×104CFU/mL。王靜等［16］以膠體金做標(biāo)記物，建立了大腸桿菌O157膠體金免疫層析快速篩查方法，檢測(cè)能在15min內(nèi)完成，檢測(cè)限為1×105CFU/mL。

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種由Ⅱ～Ⅵ族元素或Ⅲ～V族元素組成，直徑在1～10nm的半導(dǎo)體熒光納米粒子［17，18］。量子點(diǎn)中電子的能量狀態(tài)與原子相似，由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，所以量子點(diǎn)受激后可以發(fā)射熒光。量子點(diǎn)顯示出了優(yōu)良的熒光特性，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性好，分別是傳統(tǒng)熒光染料的1 000倍和100倍，幾乎不受環(huán)境的影響，抗光漂白性強(qiáng)，可以反復(fù)激發(fā)，有利于長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)觀察。蔡朝霞等［19］利用化學(xué)偶聯(lián)劑使得量子點(diǎn)表面基團(tuán)與菌體之間的成功結(jié)合，建立了一種快速簡(jiǎn)便的大腸桿菌定量檢測(cè)分析方法，但此法幾乎沒有特異性。王玉嬌等［20］利用量子點(diǎn)甘露糖與大腸桿菌表面含有的FimH凝集素的特有識(shí)別性質(zhì)，通過配體交換合成甘露糖修飾的量子點(diǎn)，作為檢測(cè)大腸桿菌的熒光探針，但此法針對(duì)大腸桿菌的特異性識(shí)別程度不如大腸桿菌抗原抗體反應(yīng)。Wu等［21］利用兔抗山羊抗體交聯(lián)水溶性ZnS/CdSe量子點(diǎn)，合成了量子點(diǎn)熒光免疫探針，其方便性和特異性佳，應(yīng)用廣泛。在免疫層析技術(shù)中，相比于其他標(biāo)記物，以量子點(diǎn)為標(biāo)記物，由于其基于熒光顯色，抗干擾性和檢測(cè)靈敏度理論上都更強(qiáng)。結(jié)合量子點(diǎn)的優(yōu)良熒光性質(zhì)和抗原抗體反應(yīng)的特異性，本研究擬應(yīng)用雙抗體夾心量子點(diǎn)免疫層析法檢測(cè)大腸桿菌O157：H7，并評(píng)價(jià)該方法的靈敏度、特異性、和適用性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

分析天平：FA1004B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

磁力攪拌加熱器：CJJ79－1型，金壇大地自動(dòng)化儀器廠；

超純水機(jī)：ZWL－LS1－10型，湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰荆?/p>

熒光分光光度計(jì)：F96pro型，上海棱光儀器有限公司；

結(jié)合墊 Gl0194、層析膜Immunopore RP、PVC底板DB－4、吸水紙H5076：上海杰一生物科技有限公司；

Te粉、巰基乙酸、硼氫化鈉、氯化鎘：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌 ATCC8739、鼠抗E.coli0157單克隆抗體（LM－Mab－01）、兔抗鼠IgG抗體：上海慧耘生物科技公司；

沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌：均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

各種細(xì)菌采用LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h，挑選特征菌落接種與液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。以生理鹽水梯度稀釋進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3 免疫層析試紙條的制備

1.3.1 量子點(diǎn)制備 采用巰基乙酸作為修飾劑制備水溶性量子點(diǎn)。稱取31.9mg Te粉和28.4mg NaBH4至預(yù)先通氮除氧的圓底燒瓶中，加5mL除氧水，磁力攪拌至Te粉完全溶解，生成NaHTe溶液；稱取114.2mg的CdCl2·2.5H2O，加入250mL去氧水溶解；用移液槍量取混合修飾劑93μL，加入氯化鉻溶液中，滴加NaOH調(diào)節(jié)pH至9，使白色絮狀沉淀完全溶解；將溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，通氮?dú)獬?，加入NaHTe溶液，100℃下加熱回流2h，得量子點(diǎn)溶液。透析純化后4℃冷藏。

1.3.2 大腸桿菌O157：H7與量子點(diǎn)偶聯(lián)最佳pH的確定

圖1 抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)原理圖Figure 1 Outline of antibody and quantum dot coupling

采用靜電結(jié)合的方法偶聯(lián)抗體蛋白和量子點(diǎn)（圖1）。移液槍取20μL純化過的量子點(diǎn)，0.1mol/L磷酸緩沖液分別調(diào)節(jié)pH 至6.2，6.7，7.2，7.7，8.2。分別向其中加入20μL兔大腸桿菌抗體EC－MAB－01，在37℃條件下，150r/min震動(dòng)反應(yīng)2h，后置于冰箱中4℃過夜。為純化反應(yīng)量子點(diǎn)大腸桿菌抗體混合物，將混合物用40 000r/min超速離心，去上清液，將沉淀用BSA溶液重懸，相同條件下離心兩次，重懸得到大腸桿菌量子點(diǎn)熒光偶聯(lián)物。采用免疫層析法確定偶聯(lián)效果［22］。

1.3.3 免疫層析試紙條組裝 免疫層析試紙由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水紙和底板構(gòu)成。樣品墊和結(jié)合墊采用BSA溶液浸泡后洗滌干燥，以減少實(shí)際檢測(cè)時(shí)的蛋白吸附。將免疫化量子點(diǎn)加入結(jié)合墊中，干燥。層析膜檢測(cè)帶和質(zhì)控帶為鼠抗E.coli0157單克隆抗體（LM－Mab－01）劃線。將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼于底板上，切成3mm的試紙條，－20℃低溫保藏待用。

1.3.4 試紙條特異性的評(píng)價(jià) 將濃度在1×107CFU/mL的大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、黃色葡萄球菌各取0.5mL，以制備好的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)。

1.3.5 試紙條靈敏性評(píng)價(jià) 將大腸桿菌O157：H7菌懸液按10倍梯度稀釋制備的1×101～1×108CFU/mL大腸桿菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔，待免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后，在紫外燈下觀察質(zhì)控線和檢測(cè)線。

1.3.6 試紙條在食品樣品中檢測(cè)適用性評(píng)價(jià) 選取火腿腸為肉制品模擬物作檢驗(yàn)對(duì)象。稱取1g火腿腸加4mL超純水搗碎，濾去火腿腸渣，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL火腿腸濾液中，得到肉制品待測(cè)液。選取純牛奶為乳制品模擬物作檢測(cè)對(duì)象，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL牛奶中，得到乳制品待測(cè)液。選取小白菜為蔬菜品模擬物作檢測(cè)對(duì)象，剪下表面積約5cm2的葉子加水4mL搗碎，濾去葉渣，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL小白菜濾液中，得蔬菜待測(cè)液。3個(gè)樣品分別10倍梯度稀釋成菌濃度約1×105，1×104，1×103CFU/mL待測(cè)。各個(gè)待測(cè)樣取100μL的待測(cè)液體用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點(diǎn)的透射電鏡及X衍射分析

將等體積比的異丙醇倒入CdTe量子點(diǎn)水溶液中，充分?jǐn)嚢?，沉淀，離心后，將得到的固體產(chǎn)品置于真空干燥箱中干燥得到CdTe量子點(diǎn)固體粉末。

如圖2所示，利用本試驗(yàn)方法制備的CdTe量子點(diǎn)在水溶液中具有很好的分散性與穩(wěn)定性，CdTe量子點(diǎn)呈近似球形，尺寸大約在5nm左右，分散均勻。X衍射如圖3所示，CdTe量子點(diǎn)結(jié)晶性良好，其晶型結(jié)構(gòu)為閃鋅礦立方晶相。

圖2 CdTe量子點(diǎn)的TEM圖像Figure 2 TEM photography of CdTe QDs

圖3 CdTe量子點(diǎn)的X衍射圖譜Figure 3 XRD pattern of CdTe QDs

2.2 量子點(diǎn)與大腸桿菌抗體的偶聯(lián)效果

量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜顯示，550～700nm為熒光發(fā)射峰波段，發(fā)射峰為620nm，半峰寬為75nm，熒光發(fā)射峰對(duì)稱性好。CdTe量子點(diǎn)在與大腸桿菌抗體偶聯(lián)之后，最大熒光值及發(fā)射峰的半峰寬都沒有變化（見圖4），表明CdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌O157：H7抗體偶聯(lián)之后，分散性保持良好，沒有聚團(tuán)，其熒光性質(zhì)保持穩(wěn)定［23］。熒光發(fā)射峰位置紅移了2nm，引起發(fā)射峰位置移動(dòng)的原因可能是，CdTe量子點(diǎn)在與蛋白質(zhì)通過電荷相互作用的過程中，由于蛋白質(zhì)大分子偶聯(lián)多個(gè)量子點(diǎn)，從而引起其偶極相互作用增加，斯托克斯位移增大，發(fā)射光譜紅移［24］。

圖4 量子點(diǎn)與大腸桿菌O157：H7抗體靜電偶聯(lián)前后熒光圖譜對(duì)比Figure 4 Comparison of fluorescence spectrum before and after electrostatic coupling

如圖5所示，在層析法驗(yàn)證量子點(diǎn)與大腸桿菌抗體偶聯(lián)效果中，pH 6.7，7.2，7.7時(shí)出現(xiàn)了兩條明顯的熒光帶，其中7.2尤其清晰。說明靜電偶聯(lián)的辦法是可行的，偶聯(lián)之后能保持抗體的特異性，并且最佳偶聯(lián)pH值為7.2。大腸桿菌單克隆抗體是一種免疫球蛋白，其等電點(diǎn)為pI 8.0，在pH為8時(shí)，其不適用結(jié)合其他物質(zhì)。在pH＜8時(shí)，免疫球蛋白帶正電荷。以巰基乙酸為穩(wěn)定劑合成的量子點(diǎn)表面為巰基和羧基，且在堿性條件下合成，其表面帶負(fù)電。由于帶電性相反，兩者在溶液中容易發(fā)生靜電吸引從而產(chǎn)生偶聯(lián)。理論上來說，量子點(diǎn)與抗體之間的帶電差異越大偶聯(lián)越好，所以應(yīng)在偏堿環(huán)境偶聯(lián)，具體在pH 7～8進(jìn)行，這在試驗(yàn)結(jié)果中得到驗(yàn)證。綜上，量子點(diǎn)與大腸桿菌抗體靜電偶聯(lián)技能保持量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)也能保持抗體的特異性，是一種成功的偶聯(lián)方式。

圖5 不同pH值下量子點(diǎn)與大腸桿菌的偶聯(lián)效果Figure 5 Coupling effect observation of quantum dots in Escherichia coli under UV lamp

2.3 量子點(diǎn)免疫層析試紙條組裝

如圖6所示，量子免疫層析試中羊抗兔二抗為質(zhì)控線，大腸桿菌抗體為檢測(cè)線，分別用劃膜儀固定在硝酸纖維膜上，結(jié)合墊采用量子點(diǎn)大腸桿菌抗體偶聯(lián)物浸潤(rùn)，在37℃條件下經(jīng)干燥后制得。將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，按順序粘貼到PVC底板上，各部分重疊以保證樣品液體的流動(dòng)。其檢測(cè)原理為雙抗體夾心法，在檢測(cè)過程中，樣品中的大腸桿菌在毛細(xì)作用下往吸水紙方向移動(dòng)，結(jié)合墊中的量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物會(huì)標(biāo)記到大腸桿菌上，在繼續(xù)往吸水紙方向移動(dòng)的過程中，檢測(cè)線上的大腸桿菌抗體會(huì)將標(biāo)記量子點(diǎn)的大腸桿菌捕獲，形成檢測(cè)帶，未標(biāo)記大腸桿菌的量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物繼續(xù)移動(dòng)至質(zhì)控線被羊抗兔二抗捕獲形成質(zhì)控線。

2.4 量子點(diǎn)免疫層析試紙?zhí)禺愋栽u(píng)價(jià)

圖6 量子點(diǎn)免疫層析試紙結(jié)構(gòu)圖Figure 6 Structure of QDs immunochromatographic strip

用純凈水分別稀釋各種細(xì)菌至1×107CFU/mL，各取0.5mL滴加至量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙上進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7）表明，大腸桿菌O157：H7樣品呈陽性反應(yīng)，其余樣品均為陰性反應(yīng)，包括沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌。試驗(yàn)顯示，大腸桿菌O157：H7量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條與其它細(xì)菌之間不發(fā)生反應(yīng)，其特異性良好。

圖7 量子點(diǎn)免疫層析試紙?zhí)禺愋詼y(cè)試Figure 7 Specific test of QDs immunochromatographic strips

2.5 量子點(diǎn)免疫層析試紙靈敏度評(píng)價(jià)

大腸桿菌O157：H7最初源于出血性結(jié)腸炎病的人畜及感染此菌的人畜排泄物。在處理不到位的地區(qū)，這些排泄物通過一些方式，會(huì)釋放到水體，對(duì)水體造成污染。將大腸桿菌O157：H7樣品用自來水按照10倍梯度稀釋，通過傾注平板法測(cè)得其濃度分別約為1×108，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101CFU/mL。分別取100μL不同濃度的菌懸液用量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)，結(jié)果最低的檢出濃度為1×104CFU/mL，同市售的大腸桿菌O157：H7膠體金免疫層析試紙檢測(cè)相比，其最低檢測(cè)濃度要低一個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度更高（見圖8）。

圖8 兩種免疫層析試紙靈敏度測(cè)試對(duì)比Figure 8 Contrast of sensitivity testing of two kinds immunochromatographic strip

2.6 量子點(diǎn)免疫層析試紙適用性評(píng)價(jià)

受大腸桿菌的生物學(xué)性質(zhì)影響，肉制品的生產(chǎn)加工過程中極易產(chǎn)生大腸桿菌污染事件［25，26］。牛、羊、豬等動(dòng)物是大腸桿菌O157：H7的宿主，會(huì)由于肉制品本身攜帶、操作工人攜帶、不按規(guī)范操作導(dǎo)致產(chǎn)品污染［27］。乳制品中大腸桿菌污染也非常常見，同肉制品一樣，乳制品來源于動(dòng)物，且主要為牛奶，其生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過程中也容易受大腸桿菌的污染［28］。蔬菜中的大腸桿菌污染主要來自農(nóng)家肥的使用，清洗不凈會(huì)導(dǎo)致致病菌的殘留。此外，肉制品和乳制品能為大腸桿菌O157：H7的生長(zhǎng)提供極佳的環(huán)境，因此容易造成其大規(guī)模富集。

實(shí)際的檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙?jiān)趯?shí)際樣品中適用性良好，在肉制品、乳制品和蔬菜樣品中靈敏性與在自來水中檢測(cè)相當(dāng)。與膠體金試紙條相比，其靈敏度仍要高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

表1 量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙適用性測(cè)試Table 1 Applicability test of quantum dot fluorescent immune chromatography

量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙保藏于－20℃的低溫冰箱中。分別在保藏1，3，5，10，20，30，40，50，60d時(shí)用試紙對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，60d內(nèi)在－20℃條件下，量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙中的抗體保持良好的活性，量子點(diǎn)熒光性質(zhì)穩(wěn)定，整個(gè)試紙的性質(zhì)保持良好。

3 討論

大腸桿菌O157：H7是一個(gè)全球范圍的公共衛(wèi)生問題，各國(guó)都將其列為必檢項(xiàng)目［29］。其各種檢測(cè)技術(shù)中，以免疫層析技術(shù)的檢測(cè)最為方便快捷，現(xiàn)最流行的為膠體金免疫層析技術(shù)。在檢測(cè)某些目標(biāo)物質(zhì)濃度較低的樣品時(shí)，膠體金本身的顏色太淺，無法使用肉眼進(jìn)行判斷。量子點(diǎn)具有極佳的熒光性質(zhì)，激發(fā)光譜寬，熒光強(qiáng)度高而且穩(wěn)定，十分有利于降低免疫層析技術(shù)的檢測(cè)限。本試驗(yàn)將大腸桿菌抗體與羊抗兔二抗劃線固定于層析膜，量子點(diǎn)大腸桿菌單克隆抗體偶聯(lián)物浸潤(rùn)與結(jié)合墊干燥，通過構(gòu)建免疫層析系統(tǒng)，完成了量子點(diǎn)大腸桿菌熒光免疫層析試紙。該法不僅結(jié)合了免疫反應(yīng)與層析技術(shù)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)，并且相比于膠體金試紙，由于量子點(diǎn)基于熒光顯色，因而其抗干擾性更強(qiáng)，檢測(cè)限更低。本研究構(gòu)建的量子點(diǎn)試紙的特異性良好，最低檢測(cè)限為104CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間小于5min，能適用于多種實(shí)際樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于2011年全國(guó)食物中毒事件報(bào)告情況的通報(bào)［Z/OL］.衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)［2012］18號(hào)（2012—02—24）［2013—07—20］.http：//www.moh.gov.cn/mohwsbwstjxxzx/s7967/201202/54200.shtml.

2 中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于2012年全國(guó)食物中毒事件報(bào)告情況的通 報(bào) ［Z/OL］.衛(wèi) 辦 應(yīng) 急發(fā) ［2013］4 號(hào) （2013—03—04）［2013—07—20］.http：//www.moh.gov.cn/mohwsbwstjxxzx/s7967/201303/b70872682e614e4189d0631ae5527625.shtml.

3 中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于2013年全國(guó)食物中毒事件報(bào)告情況的通報(bào)［Z/OL］.衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)［2014］15號(hào)（2013—02—20）［2014—09—21］.http：//www.moh.gov.cn/yjb/s3585/201402/f54f16a4156a460790caa3e991c0abd5.shtml.

4 中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于2014年全國(guó)食物中毒事件報(bào)告情況的通 報(bào) ［Z/OL］.衛(wèi) 辦 應(yīng) 急發(fā) ［2015］9 號(hào) （2015—02—15）［2015—03—12］.http：//www.moh.gov.cn/yjb/s3585/201502/91fa4b047e984d3a89c16194722ee9f2html.

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