紫蘇葉多糖活性炭脫色工藝優(yōu)化

張麗紅 謝三都 徐 芳 林曉燕 高 寧（.漳州職業(yè)技術學院，福建 漳州 363000；.福建師范大學閩南科技學院，福建 泉州 3633）

紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt.］屬唇形科紫蘇屬，是藥食兩用的一年生草本植物［1－3］。其葉片中含有9種花色素苷及順式異構體，其中以丙二?；咸K寧和紫蘇寧最為典型［4－6］。在紫蘇葉多糖提取過程中，水溶性的花色素苷與多糖一起被提取出來，導致產(chǎn)品呈現(xiàn)黑紫色或紅紫色，降低了紫蘇葉多糖的純度，不利于進一步研究。

目前，有關植物多糖脫色的方法主要有化學方法和物理方法兩種。化學方法一般是通過化學物質(zhì)本身所具有的強氧化性破壞色素結構而不呈現(xiàn)顏色達到脫色目的，如雙氧水［7，8］，但容易造成目標物質(zhì)被破壞而產(chǎn)生嚴重損失。物理方法是通過吸附劑對色素顆粒的吸附作用使其與目標物質(zhì)分離而達到脫色目的，常見的吸附劑有活性炭［9－11］和大孔樹脂［12－14］。到目前為止，未見有關紫蘇葉多糖脫色的研究性報道。

本研究擬以紫蘇葉多糖提取液的脫色率和多糖損失率為指標，考察活性炭類型、活性炭用量、脫色時間、脫色溫度、脫色pH對紫蘇葉多糖脫色效果的影響，并采用響應曲面法優(yōu)化對各因素進行優(yōu)化，提高了紫蘇葉多糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑紫蘇：2013年7月采摘自南安市碼頭鎮(zhèn)野生紫蘇葉片；粉末活性炭（過120目標準樣篩）、條形活性炭、椰殼活性炭：福建省南平元力活性炭有限公司；

D（＋）－無水葡萄糖、檸檬酸、苯酚、濃H2SO4等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV－2802S型，龍尼柯上海儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－8型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯pH計：PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇葉多糖提取液制備流程

新鮮紫蘇葉→預處理→浸提→過濾→活性炭處理→過濾、離心→上清液→產(chǎn)品

1.2.2 脫色率的計算

（1）紫蘇葉提取液吸收峰的檢測：將紫蘇葉多糖提取液經(jīng)全波段掃描，設備參數(shù)：中速掃描、波長間隔1.0nm、波長范圍190.0～1 100.0nm。

全波段掃描結果顯示，在波長為330nm處有吸收峰，故以該波長作用檢測波長。

（2）脫色率的計算：根據(jù)式（1）計算脫色率：

式中：

Y1——紫蘇葉多糖提取液的脫色率，%；

OD0——原樣品在波長為330nm處的吸光度；

OD1——處理后的樣品在波長為330nm處的吸光度。

1.2.3 多糖損失率的計算 采用苯酚—硫酸法［15］測定樣品中多糖的含量，并按式（2）計算紫蘇葉多糖損失率：

式中：

Y2——紫蘇葉多糖損失率，%；

m0——原樣品中紫蘇葉多糖含量，g；

m1——處理后樣品中紫蘇葉多糖含量，g。

1.2.4 紫蘇葉多糖提取液活性炭脫色工藝的單因素試驗

（1）活性炭類型：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）分別添加粉末活性炭、條形活性炭、椰殼活性炭的量均為0.5%，在40℃下脫色20min后過濾，計算脫色率和多糖損失率。

（2）活性炭用量：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）分別添加0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，2.00%的活性炭在40℃下脫色20min后過濾，計算脫色率和多糖損失率。

（3）脫色時間：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭在40℃下分別脫色5，10，15，20，25，30min后過濾，計算脫色率和多糖損失率。

（4）脫色溫度：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭分別在30，40，50，60，70，80℃下脫色20min后過濾，計算脫色率和多糖損失率。

（5）pH值：采用磷酸緩沖液調(diào)整樣品的pH分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.7，7.0，7.5，8.0后添加0.75%的活性炭、在60℃下脫色20min后過濾，計算脫色率和多糖損失率。

1.2.5 響應面法優(yōu)化活性炭脫色工藝 在單因素試驗基礎上，以脫色率（Y1）和多糖損失率（Y2）作為響應值，根據(jù)BBD中心組合設計的原理［16，17］進行響應曲面優(yōu)化，確定活性炭脫色的最優(yōu)條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Design－Expert 7.1.3數(shù)據(jù)處理軟件對響應結果進行二次多項回歸擬合、方差分析、顯著性檢測、響應面分析和工藝驗證實驗。

2 結果與分析

2.1 活性炭種類對脫色效果的影響

由圖1可知，采用粉末型活性炭的脫色效果最好：脫色率高、多糖損失少。活性炭是通過對色素顆粒的物理性吸附并隨活性炭的去除達到脫色目的，與條形活性炭和椰殼活性炭比較，粉末活性炭的比表面積（800～2 000m2/g）最大，吸附能力強，具有速度快、脫色率高、成本低等優(yōu)點［18－21］。因此，本試驗采用粉末型活性炭作用為脫色劑。

圖1 不同活性炭種類的脫色效果Figure 1 Effect of the types of activated charcoal on the decolorization

2.2 活性炭用量對脫色效果的影響

由圖2可知，活性炭用量的增加，使得紫蘇葉多糖提取液的脫色率逐漸增加后趨于平穩(wěn)，這是因為隨著活性炭用量增加，紫蘇葉多糖提取液中的色素顆粒幾乎被去除而使脫色率增長緩慢；而當脫色率趨于穩(wěn)定時，多余的活性炭轉(zhuǎn)而吸附多糖導致多糖損失明顯地增大，綜合脫色率和多糖損失率兩個指標試驗結果，活性炭用量宜選擇0.75%左右為宜。

圖2 不同活性炭用量的脫色效果Figure 2 Effect of activated carbon dosage on decolorization

2.3 脫色時間對脫色效果的影響

由圖3可知，伴隨著脫色時間的增加，紫蘇葉多糖提取液脫色率呈先增加后略有下降的趨勢，而多糖損失率呈先下降后上升的趨勢。當活性炭用量一定時，色素顆粒與多糖分子間存在競爭性吸附關系，因此，脫色時間僅為5min時，脫色率較低而多糖損失率較高；活性炭吸附屬物理過程，是一種動態(tài)的吸附與解析的過程［22］，因此，隨著脫色時間延長，多糖分子解析而色素顆粒進一步吸附導致脫色率繼續(xù)上升而多糖損失率下降的現(xiàn)象；繼續(xù)延長脫色時間，色素顆粒可能存在解析過程和多糖分子再吸附緣故而出現(xiàn)脫色率略有下降而多糖損失率上升的現(xiàn)象。

2.4 脫色溫度對脫色效果的影響

圖3 不同脫色時間的脫色效果Figure 3 Effect of decoloring time on decolorization

圖4 脫色溫度對紫蘇葉多糖脫色效果的影響Figure 4 Effect of decoloring temperature on decolorization

由圖4可知，隨著脫色溫度的升高，紫蘇葉多糖提取液脫色率逐漸增加，但持續(xù)的高溫并未使脫色率顯著上長反而導致多糖損失明顯增加。這是由于溫度升高有利于分子擴散運動及多糖分子的解析從而加強了色素顆粒與活性炭之間的吸附［21］。在較低溫度條件下，由于多糖分子解析速度加快而使紫蘇葉多糖損失率逐漸下降，但升高溫度可能是由于較高溫度破壞了多糖結構導致?lián)p失率的增加。綜合脫色效果，本試驗宜采用60℃左右的脫色溫度。

2.5 pH值對脫色效果的影響

由圖5可知，隨著pH的上升，紫蘇葉多糖提取液脫色率總體呈下降趨勢，多糖損失率呈先下降后上升的趨勢。這是因為一般情況下，活性炭在酸性條件下比在堿性條件下的吸附能力強，而多糖在堿性條件下比在酸性條件下穩(wěn)定。因此，選擇pH 5.5時脫色效果較好。

圖5 不同pH值的脫色效果Figure 5 Effect of pH on decolorization

2.6 響應面試驗結果分析

2.6.1 響應面的試驗設計及結果 根據(jù)單因素試驗結果設計響應曲面法的因素水平編碼表，見表1。

表1 響應面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

根據(jù)Box－Benhnken設計方案進行響應面試驗，所得結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.6.2 模型回歸擬合 經(jīng)多元回歸擬合后，得到紫蘇葉多糖脫色率（Y1）和紫蘇葉多糖損失率（Y2）對活性碳用量、脫色時間、脫色溫度、pH的二次多項回歸方程分別為：

2.6.3 模型有效性檢驗 為檢驗響應模型的有效性，采用Design－Expert 7.1.3軟件對模型進行方差分析，所得結果見表3、4。

表3 回歸模型方差分析及系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

表3 回歸模型方差分析及系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示極顯著；“＊”表示顯著。

變異來源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 502.327 7 14 35.880 5 2.738 9 0.044 0＊X1 0.000 8 1 0.000 8 0.000 1 0.993 8 X2 72.030 0 1 72.030 0 5.498 3 0.037 1 ＊X3 11.603 3 1 11.603 3 0.885 7 0.365 2 X4 10.640 8 1 10.640 8 0.812 3 0.385 2 X1X2 74.822 5 1 74.822 5 5.711 5 0.034 1 ＊X1X3 6.002 5 1 6.002 5 0.458 2 0.511 3 X1X4 9.302 5 1 9.302 5 0.710 1 0.415 9 X2X3 0.250 0 1 0.250 0 0.019 1 0.892 4 X2X4 4.622 5 1 4.622 5 0.352 9 0.563 5 X3X4 165.122 5 1 165.122 5 12.604 4 0.004 0 ＊＊X12 33.779 3 1 33.779 3 2.578 5 0.134 3 X22 51.115 6 1 51.115 6 3.901 9 0.041 7 ＊X32 3.815 6 1 3.815 6 0.291 3 0.599 3 X42 19.934 8 1 19.934 8 1.521 7 0.241 0失擬差 155.497 5 10 15.549 8 18.222 4 0.053 1純誤差 1.706 7 2 0.853 3總和659.531 8 26

由表3可知，方程的模型顯著性P＜0.05，顯著，則模型有意義；失擬差P為0.053 1＞0.05，不顯著，即回歸模型與實際的試驗數(shù)值無明顯的差異。該模型的校正決定系數(shù)為＝0.967 2，說明該模型至少能解釋96.72%響應值的變化，僅僅只有總變異大約3.28%無法解釋；而相關系數(shù)為R2＝0.961 6，表明該模型具有良好的擬合程度，試驗誤差小，該模型可用于預測脫色過程色素脫除情況。模型一次項X2（P＜0.05）的系數(shù)顯著，交互項 X1X2（P＜0.05）的系數(shù)顯著、X3X4（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著，二次項 X22（P＜0.05）的系數(shù)顯著，其他項系數(shù)均不顯著。平方項對響應值有影響，說明響應值與試驗因素之間并不是簡單的線性關系［23］。

由表4可知，方程的模型顯著性P＜0.000 1，極顯著，則模型有意義；失擬差P為0.593 5＞0.05，不顯著，即回歸模型與實際的實驗值無明顯差異。模型校正決定系數(shù)＝0.921 3，說明該模型至少能解釋92.13%響應值的變化，但仍然有總變異大約7.87%無法解釋；相關系數(shù)R2＝0.929 5，表明該模型具有良好的擬合程度，試驗誤差小，該模型可用于預測脫色過程中多糖損失情況。模型一次項X1、X2、X4（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著；二次項 X22（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著；交互項X2X4（P＜0.000 1）的系數(shù)極顯著，其他項系數(shù)均不顯著。平方項對響應值有影響，說明響應值與試驗因素之間并不是簡單的線性關系。

2.6.4 響應面分析 根據(jù)響應曲面圖和等高線圖能直觀分析各考察因素之間的交互作用及與響應值之間的關系，見圖6～11。

表4 回歸模型的方差分析及系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

表4 回歸模型的方差分析及系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示極顯著；“＊”表示顯著。

變異來源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 4 994.615 4 14 356.758 2 10.034 1 ＜0.000 1＊＊＊X1 660.083 3 1 660.083 3 18.565 4 0.000 9 ＊＊X2 672.003 3 1 672.003 3 18.900 6 0.000 9 ＊＊＊X3 92.407 5 1 92.407 5 2.599 0 0.132 9 X4 948.740 8 1 948.740 8 26.684 1 0.000 2 ＊＊X1X2 39.062 5 1 39.062 5 1.098 7 0.315 2 X1X3 7.840 0 1 7.840 0 0.220 5 0.647 1 X1X4 31.922 5 1 31.922 5 0.897 8 0.362 1 X2X3 30.250 0 1 30.250 0 0.850 8 0.374 5 X2X4 1 207.562 5 1 1 207.562 5 33.963 7 ＜0.000 1 ＊＊＊X3X4 42.902 5 1 42.902 5 1.206 7 0.293 5 X12 1.001 5 1 1.001 5 0.028 2 0.869 5 X22 731.120 4 1 731.120 4 20.563 4 0.000 7 ＊＊X32 0.171 2 1 0.171 2 0.004 8 0.945 8 X42 148.637 9 1 148.637 9 4.180 6 0.063 5失擬差 356.367 5 10 35.636 8 1.0140 4 0.593 5純誤差 70.286 7 2 35.143 3總合5 421.269 6 26

由圖6（a）可知，活性炭用量和脫色時間對紫蘇葉多糖提取液的脫色率的影響明顯，曲線變化均較為陡峭，但從等高線圖可知二者的交互作用不顯著。由圖6（b）可知，活性炭用量和脫色時間對紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，曲線變化較為陡峭，二者的交互作用顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。

由圖7（a）可知，活性炭用量對紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，脫色溫度的影響不明顯，且二者的交互作用不顯著。由圖7（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故活性炭用量和脫色溫度對紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

圖6 活性炭用量和脫色時間對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 6 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring time on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由圖8（a）可知，活性炭用量和pH對紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。由圖8（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故活性炭用量和pH對紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

圖7 活性炭用量和脫色溫度對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 7 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖8 活性炭用量和pH對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 8 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖9 脫色時間和脫色溫度對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 9 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由圖9（a）可知，脫色時間對紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，脫色溫度的影響不明顯；等高線圖呈橢圓形，說明二者的交互作用顯著。由圖9（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色時間和脫色溫度對紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

由圖10（a）可知，脫色時間和pH對紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯；等高線圖呈橢圓形，說明二者的交互作用顯著。由圖10（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色時間和pH對紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

由圖11（a）可知，脫色溫度和pH對紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。由圖11（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色溫度和pH對紫蘇葉多糖損失率有影響，但二者的交互作用不顯著。

圖10 脫色時間和pH對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 10 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖11 脫色溫度和pH對紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應Figure 11 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring temperature and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

2.6.5 工藝驗證實驗 采用 Design－Expert7.1.3軟件分析回歸模型，得出紫蘇葉多糖的最優(yōu)脫色工藝參數(shù)：活性炭用量0.58%，脫色時間15min，脫色溫度50℃，pH 6.0，紫蘇葉多糖脫色率的預測值為99.99%，紫蘇葉多糖損失的預測值為5.05%。采用上述優(yōu)化的脫色工藝條件進行驗證實驗，所得紫蘇葉多糖脫色率為99.63%、紫蘇葉多糖損失率為5.25%，與理論預測值差別不大。

3 結論

植物色素苷在紫蘇葉片中大量存在且與所提取的多糖具有相同的溶解性能，均為水溶性。提取時，大量的色素被提取出來混入多糖中，為了進一步研究紫蘇葉多糖的生物活性、多糖組成及結構等，必須對其進行分離純化。活性炭法脫色具有吸附性能強、反應條件溫和、操作簡便等優(yōu)點，成為植物多糖脫色處理的常用方法之一。在單因素試驗基礎上，響應面法優(yōu)化活性炭脫色的結果表明，紫蘇葉多糖提取液的最佳活性炭脫色工藝條件為：活性炭用量0.58%，pH 6.0，溫度50℃，時間15min，紫蘇葉多糖提取液脫色率達99.99%，多糖損失率為5.05%。與其它植物多糖脫色工藝比較，本研究具有高脫色率、低多糖損失的優(yōu)點。

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