山羊瘤胃中單寧降解菌的分離、篩選和鑒定

李興芳 徐 雯 張勝男 徐高蹺 汪珊如 王士長 梁世忠*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005;2.南寧學(xué)院，南寧 530200)

單寧是是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，味澀，并且具有抑菌作用，影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用［1-3］。降解單寧的微生物能夠分泌一種酶，此酶可以對單寧產(chǎn)生抗性并使單寧發(fā)生降解［4-7］。

一些家畜和野生動物(如綿羊、山羊、鹿和麋鹿)的消化道中有單寧降解菌，有助于這些動物利用高單寧飼料。Skene等［8］于1995年首次從飼喂富含單寧牧草的山羊瘤胃中分離出了的厭氧菌反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)，該菌不僅能夠降解單寧，還可以利用其降解產(chǎn)物;Odenyo等［9］在一些非洲反芻動物的瘤胃液中也發(fā)現(xiàn)耐受單寧或降解單寧的微生物;Goel等［10］從沒有采食含單寧飼糧的山羊糞便中分離到6株可以分解單寧-蛋白質(zhì)結(jié)合物的革蘭氏陽性球菌(gram-positive cocci)，并通過分析證明它們屬于不同的D型糞鏈球菌(Enterococcus faecalis)，其中降解單寧能力最強的糞鏈球菌GF1在含單寧4%的培養(yǎng)基上也可以正常生長;Singh［11］從放養(yǎng)山羊瘤胃中分離出16株厭氧單寧降解菌，其中1株菌能夠耐受3.5%的單寧酸，并且能將單寧降解為沒食子酸和焦棓酸，經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定為路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)GRT-1。

本試驗從采食富含單寧的植物的原生態(tài)山羊瘤胃中分離好氧及兼性厭氧的細菌，通過單寧濃度耐受培養(yǎng)基和單寧酶活力鑒定培養(yǎng)基篩選降解單寧的細菌，并通過16S rDNA基因序列測定分析對4株菌進行初步鑒定，再將菌株在單寧濃度為0.5%、1%、1.5%的單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行胞內(nèi)酶活力測定，以期為單寧降解菌在實際生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑及主要來源

沒食子酸丙酯:購于上海生工生物工程有限公司。單寧酸(分子質(zhì)量1 701.20 ku)、蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂、Taq酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、DNA Marker DL2000、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素(Sigma分裝)、氯化鈉、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、飽和酚、氯仿、異戊醇、蛋白酶K、溶菌酶、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸、Tris、冰乙酸、無水乙醇均為分析純，購于上海生工生物工程有限公司。引物:上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 樣品采集

采集廣西省天然山林放牧養(yǎng)殖的隆林山羊瘤胃，在無菌環(huán)境下刮取瘤胃上皮和取瘤胃內(nèi)容物，過濾將樣品的固液相分離，立即用于菌株分離。

1.1.3 培養(yǎng)基

單寧濃度耐受培養(yǎng)基:牛肉浸膏2.5 g，蛋白胨 5 g，瓊脂 6 g，氯化鈉 2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到450 mL，pH 7.2，滅菌，分別添加10%、20%、30%、40%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為1%、2%、3%、4%。另配制用蒸餾水代替單寧酸水溶液的不含單寧的普通培養(yǎng)基。

單寧酶鑒定培養(yǎng)基a:牛肉浸膏2.5 g，氯化鈉2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，蛋白胨 5 g，瓊脂 6 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到400 mL，pH 4.5，滅菌，加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，加0.04%的溴酚藍水溶液50 mL，混合。

單寧酶鑒定培養(yǎng)基b:瓊脂6 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到 400 mL，pH 4.5，滅菌，加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，加0.04%的溴酚藍水溶液50 mL，混合。

單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(液體):牛肉浸膏2.5 g，蛋白胨5 g，氯化鈉 2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到 450 mL，pH 7.2，滅菌，分別添加5%、10%、15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為0.5% 、1% 、1.5% 。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選［11］

1.2.1.1 初篩

設(shè) A、B、C、D 4組，每組3個重復(fù)。A、B 組接種瘤胃液，C、D組接種瘤胃固相內(nèi)容物;A、C組0.27×10-3×g 37 ℃ 搖床過夜培養(yǎng);B、D 組放于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。然后將A、B、C、D 4組富集培養(yǎng)的細菌接種到24個不加單寧的普通培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)。再將24個培養(yǎng)基上的細菌轉(zhuǎn)接到含不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，將菌落純化后，保存。

1.2.1.2 復(fù)篩

1)將篩選出的幾株菌分別接種到含單寧酶鑒定培養(yǎng)基a和b上，當(dāng)菌落周圍顏色變?yōu)辄S色，則證明有單寧酶產(chǎn)生，觀察顏色的變化，從而確定出酶活力較強的幾株菌。

2)將1)中篩出的幾株菌分別接種到不同單寧酶鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，比較酶活力。

3)將篩選出活力較高的菌株，分別接種于10 mL單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃ 0.27×10-3×g振蕩培養(yǎng)16～24 h，-80℃保存，用于菌株鑒定和酶活力測定。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 所篩菌株基因組DNA的提取、PCR擴增

提取所篩選菌株的基因組DNA，選用細菌通用引物，上游27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTGAG-3';下游 1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。對山羊瘤胃內(nèi)單寧降解菌的基因組DNA進行PCR擴增，終體積為25μL，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，共 30 個循環(huán)［12］。1.2.2.2 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測

取2～3μL產(chǎn)物與1μL溴酚藍上樣緩沖液混合，上樣到1%的瓊脂糖凝膠孔中，在100 V 60 mA條件下，電泳60 min，放置于溴化乙錠(EB)中染色15～20 min，并在紫外分析儀下觀測，然后放于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆及測序

純化與載體連接:采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化。連接反應(yīng)采用pGEM-T載體試劑盒，將準(zhǔn)備好的反應(yīng)體系放于4℃孵育過夜，得到最大數(shù)目的轉(zhuǎn)化菌落。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:1)輕微離心使連接產(chǎn)物匯集到管底，取2μL連接產(chǎn)物加到置于冰上的1.5 mL離心中，向管中加入50μL的DH5α感受態(tài)細胞，輕輕混勻，并在冰浴中放置30min;2)42℃水浴中熱激45 s后快速轉(zhuǎn)至冰浴中2 min，注意在此過程不要搖動離心管;3)向離心管中加入滅菌的500μL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混合均勻后在37℃ 0.76×10-3×g條件下培養(yǎng)1 h，復(fù)蘇細菌;4)分別取200μL已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基涂到2個LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，37℃正向放置1～2 h后，倒置過夜培養(yǎng);5)將過夜培養(yǎng)的平板放于4℃2～3 h后，每個平板挑取5個白色菌落分別接種于10 mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。

陽性克隆的鑒定及測序:采用一種簡單的酚/氯仿/異戊醇抽提法，將重組質(zhì)粒DNA抽提出來，鑒定出陽性重組子。鑒定出的陽性克隆直接進行菌液PCR，再一次鑒定陽性克隆，將菌液直接送于華大基因公司測序。

1.2.3 單寧酶活力測定

采用沒食子酸丙酯作為單寧酶的底物。沒食子酸丙酯的濃度會隨著酶促反應(yīng)的進行而變小，從而引起在270 nm處的吸光值(OD)降低，根據(jù)沒食子酸丙酯吸光值的變化，計算出單寧酶的活力。將篩選得到的菌株接種到單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(單寧濃度0.5%、1%和1.5%)中，37 ℃，120 r/min 震蕩培養(yǎng)，待 OD600nm約為0.4～0.6時，收集菌體，加入36 μL的溶菌酶(50 mg/mL)和3μL的Triton-100，37℃水浴15 min后，制得粗酶液，立即進行酶活力測定。酶活力的定義:40℃反應(yīng)條件下，100μL酶液每分鐘使沒食子酸丙酯溶液在270 nm處減少0.01個吸光度值定義為1個酶活力單位。

酶活力計算公式:

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，選出了4株菌，編號為No.1、No.2、No.3、No.4，結(jié)果表明，4 株菌對單寧的最大耐受濃度均為4%，但No.2、No.3 2株菌的長勢比No.1和No.4要好一些，通過單寧酶鑒定培養(yǎng)基看出菌株可以產(chǎn)生單寧酶，并且可以看出細菌在只有瓊脂和溴酚藍的單寧酶鑒定培養(yǎng)基b上與在含營養(yǎng)物質(zhì)和溴酚藍的單寧酶鑒定培養(yǎng)基a上相比生長緩慢，菌落周圍變色緩慢，并且變色范圍比較小，因此說明直接利用單寧作為營養(yǎng)物質(zhì)的能力很低。部分菌株的單寧耐受情況見圖1，部分菌株單寧酶初步鑒定結(jié)果如圖2。

圖1 No.3菌株在不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上的生長狀況Fig.1 The growth status of the No.3 strain on tolerance culture medium with different tannic concentration

圖2 No.2菌株在單寧酶鑒定培養(yǎng)基a(A)和b(B)上的生長情況Fig.2 The growth status of No.2 strain on tannase identification culture mediums a(A)and b(B)

2.2 16S r DNA基因組序列測序結(jié)果

將測序所得序列提交至GenBank進行Blast序列同源性比對。選取若干同源性較高的16S rDNA序列經(jīng)ClustalX1.84程序進行比對，采用 Kimura4參數(shù)模型計算進化距離通過鄰接法和最大簡約法，運用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。No.1菌株與登錄號為EF192136的細菌親緣關(guān)系最近，該菌屬于腸桿菌目，腸桿菌科，普羅威登斯菌屬，進一步比對得出No.1菌株屬于產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens);No.2菌株與4株細菌親緣關(guān)系均比較近，基本都屬于伯克氏菌目，但經(jīng)分析判斷No.2菌株與克斯特菌屬親緣關(guān)系更為接近，因此屬于克斯特菌(Kerstersia);No.3菌株介于2大分支菌之間，但是更接近于下面1個分支菌，該菌也屬于普羅威登斯菌屬，通過比對得知No.3菌株為Providencia vermicola;No.4菌株與11株細菌親緣關(guān)系均較近，均屬于假單胞菌菌科，經(jīng)進一步分析得知屬于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

圖3 4株細菌與其同源細菌的進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of the four strains and homologous bacteria

2.3 4株篩選菌株的單寧酶活力

由表1可知，各單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均為No.2菌株的酶活力最高。各單寧濃度組酶活力比較得知，除了No.1菌株在0.5%組的單寧酶活力最大外，其他3株菌均在1%組具有最大酶活力，且這3株菌在1%組的酶活力均顯著高于0.5%與1.5%組(P＜0.05);通過 0.5%組與1.5%組比較得知，除了No.4菌株在0.5%組低于1.5%組外，其他3株都與之相反。以上分析表明，單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基1%的單寧濃度對于菌株單寧酶的產(chǎn)生具有很好的誘導(dǎo)作用，而0.5%和1.5%濃度組誘導(dǎo)作用略差，原因可能是濃度太小對菌株的刺激作用太小，而濃度太大又會對菌株生長及單寧酶的產(chǎn)生起到抑制作用。

表1 單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基單寧濃度對4株細菌酶活力的影響Table 1 Effects of tannin concentration of tannase inductive culture medium on enzyme activities of the four screened strains U/mL

3 討論

培養(yǎng)基的成分對于細菌生長所需的培養(yǎng)基，一般采用目前通用的細菌生長培養(yǎng)基即可，但是鑒于本試驗中所篩菌株的特殊性，考慮到山羊瘤胃液中可能存在菌株生長所需的特殊物質(zhì)，因此在配制培養(yǎng)基時，均加入了10%的滅菌山羊瘤胃液，通過比較顯示，加入瘤胃液后，菌株的生長狀況確實要好一些。

本試驗所篩選的菌株能夠在含單寧的培養(yǎng)基上生長，只能說明菌株能夠抵抗單寧的抑菌作用，并不能說明可以產(chǎn)生單寧酶而降解單寧，因此對于單寧降解菌的篩選需要一定的方法。目前所建立的篩選鑒定方法都是針對青霉與曲霉等真菌的。1977年Bradoo等［13］在培養(yǎng)基中只加入1%的單寧和3%的瓊脂，將菌株點種在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍的透明圈，把透明圈直徑與菌落直徑的比值作為篩選鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。2001年，郭魯宏［14］改進了篩選鑒定方法，在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為0.004%的溴酚藍，利用菌落周圍培養(yǎng)基顏色變化范圍的大小與變色的程度直觀地判斷菌株是否可以產(chǎn)生單寧酶，以及產(chǎn)酶能力的大小。2008年，保玉心［15］也利用這種方法對其試驗菌株做了篩選鑒定，效果比較明顯，從而更好地證明了這種方法的可行性。因為本試試篩選的是細菌，因此針對細菌的生長需要，培養(yǎng)基也需要相應(yīng)改變，本試驗培養(yǎng)基需要在細菌生長培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1%的單寧和0.004%的溴酚藍進行培養(yǎng)。

目前國內(nèi)外對于單寧酶基因的報道都比較少，而現(xiàn)在可用于克隆表達且相對比較成功的一般是真菌的單寧酶基因，許彬［16］將米曲霉(Aspergillus oryzae)中單寧酶基因克隆于大腸桿菌和畢赤酵母中，并得到成功表達;黃小鳳等［17］又將Aspergillus oryzae中單寧酶基因成功的克隆表達在了黑曲霉中。對于細菌的單寧酶基因克隆表達也有相關(guān)報道，Noguchi等［18］從路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)中克隆了能夠編碼613個氨基酸，并能夠表達單寧酶活力的基因tanA，同時他們在Staphylococcus lugdunensis、植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)和解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)等菌種中用tanA目標(biāo)探針進行了Southen blot印記分析，發(fā)現(xiàn)探針只在鄧葡萄球菌中有明確反應(yīng);Rodrígueza 等［19］從植物乳酸菌 ATCC 14917T中克隆出了單寧酶的編碼基因tanLpl，并且在所有L.plantarum中進行了tanLpl基因的PCR擴增，得到了預(yù)期片段大小的目的DNA片段，在L.plantarum、類植物乳桿菌(L.paraplantarum)、L.pentosus和S.gallolyticus中進行了 Southen blot印記分析，結(jié)果表明在前2種菌中都有明顯反應(yīng)。本試驗對于單寧酶基因的擴增，所得的結(jié)果并不理想，因此后續(xù)試驗還可以通過現(xiàn)有報道的產(chǎn)單寧酶菌株的單寧酶基因序列來設(shè)計合適的引物，擴增所得菌株的單寧酶基因序列，或者應(yīng)用已知單寧酶基因片段做探針，對所篩菌的DNA進行Southern印跡雜交，從而找到所篩菌株的單寧酶基因，為以后將單寧酶基因克隆到合適的有益菌中，用于發(fā)酵香蕉葉來降低單寧含量或用于食品、化妝品等行業(yè)做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

①山羊瘤胃中存在能夠降解單寧的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定，分別為Providencia alcalifaciens、Kerstersia、Providencia Vermicola 和 Pseudomonas aeruginosa。

②篩選出的4株菌單寧酶活力均較高，對單寧的最大耐受度均可達到4%。

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