不同消毒方法對TiO2涂層種植體抗菌性能的影響

寧佳，呂武龍，王磊，李長義

不同消毒方法對TiO2涂層種植體抗菌性能的影響

寧佳，呂武龍，王磊，李長義△

目的研究不同消毒方法對TiO2涂層種植體抗菌性能的影響。方法純鈦表面經(jīng)0.5%質量分數(shù)的氫氟酸酸蝕后陽極氧化，制備TiO2涂層試樣作為實驗組，以未經(jīng)處理的純鈦試樣作為對照組。采用乙醇浸泡、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射3種消毒方法處理試樣。觀察試樣表面形貌，測量試樣表面粗糙度及消毒前后去離子水在試樣表面接觸角，評價試樣的細菌黏附能力；采用薄膜密著法進行活菌計數(shù)，驗證經(jīng)3種消毒方法處理后，試樣抑制金黃色葡萄球菌的功效；采用場發(fā)射掃描電鏡觀察3種消毒方法對細菌形態(tài)的影響。結果與對照組試樣相比，實驗組的表面粗糙度更大，對細菌黏附能力更強。經(jīng)紫外線照射消毒后，試樣表面接觸角小于乙醇浸泡消毒和高壓蒸汽滅菌?；罹嫈?shù)和場發(fā)射掃描電鏡觀察顯示，乙醇浸泡消毒后，試樣表面活菌數(shù)最多，細菌形態(tài)較完整；高壓蒸汽滅菌后，試樣表面活菌數(shù)較少，細菌形態(tài)受到一定程度破壞；紫外線照射消毒后，試樣表面活菌數(shù)最少，細菌形態(tài)破壞最完全。結論經(jīng)紫外線照射消毒后，試樣的抗菌性能最佳，高壓蒸汽滅菌次之，乙醇浸泡消毒效果最差。

滅菌；消毒；牙科合金；鈦；葡萄球菌，金黃色；TiO2涂層；抗菌

種植體表面陽極氧化制備TiO2納米管經(jīng)體外及動物實驗顯示出早期骨誘導作用[1-2]，具有良好的應用前景。但制備過程改變了種植體表面形貌，易造成表面生物膜的形成和種植體-組織界面免疫能力低下，出現(xiàn)種植體周組織感染等并發(fā)癥[3]。種植前消毒能夠抑制種植體表面生物膜的形成，提高種植成功率。目前關于消毒方法對TiO2涂層種植體抗菌性能的影響尚少見報道。本研究對純鈦試樣及TiO2涂層試樣接種金黃色葡萄球菌，探求乙醇浸泡消毒、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射消毒對試樣抗菌性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器高壓直流電源(DW-P401-40AC，天津市東文高壓電源廠)；磁力加熱攪拌器(CJJ78-1，江蘇金壇城西曉陽電子設備廠)；高壓蒸汽滅菌鍋（E6-18/24，EURONDA）；Talor Hobson表面粗糙度儀（Taylorsurf 60，UK）；接觸角測量儀（JGW-360A，廈門崇達智能科技有限公司）；紫外線燈管（K8W，Philips）；超凈工作臺（FLC-3，哈爾濱市東聯(lián)公司）；恒溫箱（NE6000,天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，HITACHI）。

1.2 藥品與試劑純鈦試樣（直徑15 mm，厚度0.5 mm，陜西寶雞鈦業(yè)有限公司）；氫氟酸（HF），分析純（天津市贏達稀貴化學試劑廠）；無水丙酮；無水乙醇；去離子水；PBS緩沖液（Solaibio）；牛心腦浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion,BHI,Oxoid）。金黃色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.3 覆蓋膜采用聚乙烯薄膜，裁剪成3.0 cm×3.0 cm方形薄片。實驗前用75%的乙醇溶液浸泡消毒1 min，無菌水漂洗，自然干燥備用。

1.4 樣品制備對照組：純鈦試樣。經(jīng)碳化硅砂紙序列打磨至1 500目，分別用丙酮、乙醇和去離子水超聲清洗10 min，室溫下自然干燥，取40個樣品作為對照組。實驗組：TiO2涂層試樣。方法為隨機抽取按照對照組方法處理的試樣40個，在0.5%質量分數(shù)的HF溶液中酸蝕30 min后立即用去離子水沖洗晾干；然后在0.2%質量分數(shù)的HF電解液中，以20 V電壓陽極氧化處理40 min。處理過程中始終用電磁攪拌，保持電解液的均勻和溫度恒定。陽極氧化處理結束后，用去離子水沖洗并超聲清洗，室溫下自然干燥。

1.5 樣品消毒2組分別以高壓蒸汽滅菌（134℃，0.14～0.18 MPa）、乙醇（75%）浸泡、紫外線（20 W）照射消毒，消毒時間均為1 h。對照組和實驗組分別再分為未消毒亞組、高壓蒸汽滅菌亞組、乙醇浸泡消毒亞組、紫外線照射消毒亞組，每亞組各10個試樣。

1.6 試樣表面特性檢測采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察2組試樣表面形貌。采用Talor Hobson表面粗糙度儀測試2組試樣表面粗糙度。采用輪廓算術平均偏差(Ra)、微觀不平度十點高度(Rz)來評價表面粗糙程度。取3種消毒方法及未消毒的試樣每組各10個，室溫下將去離子水10 μL滴于試樣表面，用接觸角測量系統(tǒng)采集圖像并測量接觸角。

1.7 菌液配置將凍存的金黃色葡萄球菌解凍接種于牛心腦浸液瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)24 h，用無菌接種環(huán)挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，采用麥氏比濁法配制1×106cfu/mL的菌液待用。

1.8 抗菌效能檢測參考《抗菌塑料—抗菌性能試驗方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003），采用薄膜密著法進行抗菌實驗[4]。將2組的3種消毒方法各3個試樣放入12孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別吸取10 μL菌懸液滴加在各試樣表面，覆蓋聚乙烯薄膜并平鋪，使細菌均勻接觸試樣并減少菌液揮發(fā)，37℃恒溫箱培養(yǎng)1 h后將試樣及薄膜放入9.99 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，超聲震蕩1 min后將菌液倍比稀釋，分別取100 μL接種于BHI瓊脂平板，用L型涂抹棒在平板上涂勻，平放20 min后倒轉，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

1.9 細菌形態(tài)觀察取2組試樣每種消毒方法各1個，進行上述抗菌實驗，培養(yǎng)終止后，PBS漂洗，加入2.5%戊二醛4℃浸泡12 h，之后乙醇梯度脫水，干燥。場發(fā)射掃描電鏡觀察細菌形態(tài)。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 試樣表面形貌觀察在100 μm級別的電鏡圖片上可以觀察到，對照組試樣表面較為平整光滑，實驗組試樣后有較大的溝壑樣突起，坑窩邊緣較為圓鈍，見圖1A、B。在500 nm級別的電鏡圖片上，可觀察到對照組表面仍較為平整；實驗組有均勻的TiO2納米管結構，管徑約100 nm，見圖1C、D。

Fig.1The morphology of experimental group and control group圖1 實驗組及對照組試樣表面形貌

2.2 表面粗糙度測定與對照組相比，實驗組Ra和Rz明顯增大（P＜0.05），見表1。

Tab.1The roughness in two groups表1 表面粗糙度（n=10,μm，）

Tab.1The roughness in two groups表1 表面粗糙度（n=10,μm，）

＊P＜0.05

組別對照組實驗組t Ra 0.12±0.02 0.91±0.11 22.026＊Rz 0.92±0.21 5.72±0.66 21.958＊

2.3 接觸角經(jīng)3種消毒方法處理后，實驗組接觸角均小于對照組。乙醇浸泡消毒后2組試樣表面接觸角變小，高壓滅菌后2組試樣表面觸角明顯增大，紫外線照射消毒后2組試樣表面接觸角明顯變小，見表2。

Tab.2Contact angles in two groups表2 接觸角（n=10，°，x±s）

2.4 抗菌效能乙醇浸泡消毒后，細菌存活數(shù)最多，高壓蒸汽滅菌后，細菌存活數(shù)較少，紫外線照射消毒后，細菌存活數(shù)最少。3種消毒方法處理后，TiO2涂層試樣的細菌存活數(shù)均少于純鈦試樣，見表3。

Tab.3Viable count of Staphylococcus aureus表3 金黃色葡萄球菌活菌菌落計數(shù)（cfu/mL，）

Tab.3Viable count of Staphylococcus aureus表3 金黃色葡萄球菌活菌菌落計數(shù)（cfu/mL，）

＊P＜0.05；a與乙醇浸泡消毒比較，b與高壓蒸汽滅菌比較，P＜0.05

組別對照組實驗組t n F 10 10乙醇浸泡消毒237±9 221±16 2.729＊高壓蒸汽滅菌212±13a158±10a10.460＊紫外線照射消毒195±8ab101±7ab26.741＊40.749＊247.810＊

2.5 試樣表面細菌形態(tài)觀察經(jīng)紫外線照射消毒處理后，細菌形態(tài)破壞最嚴重；高壓蒸汽滅菌處理后，細菌形態(tài)受到一定程度破壞；乙醇浸泡消毒后，細菌形態(tài)較為完整。2組試樣相對比，TiO2涂層試樣的細菌形態(tài)破壞更嚴重，經(jīng)紫外線照射消毒的效果尤為明顯，見圖2。

Fig.2The morphology of Staphylococcus aureus on specimens（SEM,×50 000）圖2 試樣表面金黃色葡萄球菌形態(tài)（SEM,×50 000）

3 討論

細胞所處的細胞外基質環(huán)境不僅包括微米尺度形貌，而且包括大量的納米尺度形貌，因此，制備具有納米和微米尺度混合表面形貌種植體表面可為細胞提供更適合附著與黏附的仿生環(huán)境[5]，促進成骨細胞活性[6]，有利于實現(xiàn)早期骨結合并增加結合強度，減少種植體周圍炎的發(fā)生[7]。酸蝕后的微米形貌已經(jīng)被廣泛認為可以促進種植體骨結合，在微米形貌上通過陽極氧化進一步得到了高度有序、垂直排列、相互平行的TiO2納米級管狀形貌，能夠很好地模擬體內(nèi)骨細胞生長的納米尺寸環(huán)境[8]。和光滑純鈦相比，本實驗所制備的試樣表面坑窩邊緣圓鈍，能夠更好地模擬骨組織中細胞外基質的的結構，從而更適合種植體骨結合。

本研究應用的消毒方法為種植體常用的高壓蒸汽滅菌、乙醇浸泡和紫外線照射[9]。金黃色葡萄球菌是口腔術后常見的感染致病菌，材料及藥物抗菌性能相關研究多以此菌為主，因此作為本研究用菌。

細菌生物膜在材料表面的附著與材料表面特性如親水性、表面能和粗糙度有關。表面粗糙度越大，則表面越粗糙，有利于細菌附著。本研究中經(jīng)表面處理的實驗組粗糙度較對照組明顯增大，Ra值達到0.82 μm以上，與金黃色葡萄球菌的直徑相似，有利于細菌的定植和黏附。而消毒方法對材料表面特性的改變會影響細菌與材料的相互作用[10]。本實驗中，紫外線消毒較乙醇浸泡和高壓滅菌消毒試樣表面接觸角明顯減小，其原因可能是紫外線照射改變了材料表面的化學成分，其產(chǎn)生的Ti-OH基團去除了試樣表面的疏水性污染物如碳氫污染[11]。

生物材料的消毒方法會影響材料的表面特性進而影響其生物活性。TiO2在紫外光的照射下可以使價帶上的電子(e-)被激發(fā)躍遷至導帶，在價帶上產(chǎn)生相應的空穴(h-)，并可在電場下分離、遷移到粒子表面，進而與吸附在表面的物質發(fā)生一系列氧化還原反應，從而發(fā)揮其抗菌作用[12]。本實驗結果顯示，紫外線照射后較高壓滅菌和乙醇浸泡消毒試樣表面存活細菌數(shù)量明顯減少，結合粗糙度和接觸角結果，TiO2涂層試樣表面黏附細菌數(shù)量多于純鈦試樣，但由于試樣表面在紫外線照射下產(chǎn)生了氧化性較強的活性基團，有效分解并殺滅細菌。因此，紫外線照射酸蝕后的TiO2納米管對細菌具有更好地殺滅作用。

實驗中掃描電鏡結果顯示，紫外線消毒的試樣表面細菌形態(tài)發(fā)生明顯變化，大部分變形、裂解甚至死亡，這與抗菌效能檢測實驗結果相符，說明紫外線消毒具有較強的抗菌性能。TiO2涂層試樣較純鈦試樣表面細菌形態(tài)皺縮更明顯，提示紫外線照射后的酸蝕TiO2納米管具有更強的抗菌性能。

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（2014-01-28收稿2014-08-04修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of different disinfection methods on antibacterial activity of TiO2nanotubes

NING Jia,LYU Wulong,WANG Lei,LI Changyi△
The Stomatological Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China△

ObjectiveTo study the influence of different kinds of disinfection methods on antibacterial activity of TiO2nanotubes.MethodsTiO2nanotubes were fabricated with 0.5%wt HF on pure titanium to acid-etching combined with an-odization as experimental group.The pure Ti was control group.They were disinfected by three kinds of disinfection methods,which were alcohol immersion,autoclaving and UV irradiation.The bacterial adhesion ability was evaluated by observing the morphology of samples,measuring the roughness and contracting angle.The film contact method was used to evaluate the antibacterial activity of samples with Staphylococcus aureus(Sa)after different infection treatment.The bacterial morphology was observed by field emission scanning electron microscope(FE-SEM).ResultsThe treatment group has higher surface roughness.The bacterial adhesion ability of experimental group was stronger compared with that of control group.The contracting angle of samples exposed to UV irradiation was smaller than that of alcohol immersion and autoclaving treatment group.The viable count and FE-SEM showed that there were more bacteria and more complete morphology on the sample surface after alcohol immersion.The viable count was less and bacterial morphology suffered some damage on the sample surface after high pressure steam sterilization.The least viable count and the most complete destruction of bacterial morphology were found after ultraviolet(UV)germicidal irradiation.ConclusionUV irradiation shows the best antibacterial activity, the second is autoclaving and the worst is alcohol immersion.

sterilization;disinfection;dental alloys;titanium;staphylococcus aureus;TiO2nanotubes;antibacterial

R783.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.022

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（郵編300070）

寧佳(1988),女,碩士在讀,主要從事口腔種植材料方面的研究

△通訊作者E-mail:Changyi_li@sina.com