活血化瘀法對(duì)急性心肌梗死大鼠CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性細(xì)胞的影響

師偉，李曄紫，趙海濱，楊丹丹，姜天元，李東方，翟瑤瑤

·基礎(chǔ)研究·

活血化瘀法對(duì)急性心肌梗死大鼠CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性細(xì)胞的影響

師偉1，李曄紫2，趙海濱2，楊丹丹2，姜天元2，李東方2，翟瑤瑤2

目的 研究活血化瘀法對(duì)大鼠心肌組織微環(huán)境中CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，探討其治療急性心肌梗死的機(jī)制。方法 Sprague-Daw ley大鼠32只隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=8)、中藥+粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)組(n=8)和G-CSF組(n=8)。各組均于造模3 h后給予相應(yīng)藥物，連續(xù)6 d，第7天處死取材。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理形態(tài)，免疫組化染色檢測(cè)梗死心肌邊緣區(qū)CD34、VEGF、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果 模型組、中藥+G-CSF組和G-CSF組CD34、VEGF、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于假手術(shù)組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組、G-CSF組高于模型組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組CD34、VEGF陽(yáng)性表達(dá)高于G-CSF組(P＜0.05)，兩組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論 活血化瘀法能夠提高CD34和VEGF的表達(dá)，其作用優(yōu)于單獨(dú)使用G-CSF，可以有效治療急性心肌梗死。

急性心肌梗死；骨髓干細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微環(huán)境；活血化瘀法

[本文著錄格式] 師偉，李曄紫，趙海濱，等.活血化瘀法對(duì)急性心肌梗死大鼠CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性細(xì)胞的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(8):894-899.

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急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AM I)產(chǎn)生的局部無(wú)收縮功能的瘢痕組織是導(dǎo)致心肌重塑、心臟破裂以及心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，AM I后動(dòng)員骨髓干細(xì)胞(CD34陽(yáng)性細(xì)胞)定向歸巢，并在梗死心肌局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下，可以達(dá)到再生心肌和血管的目的，實(shí)現(xiàn) “無(wú)創(chuàng)性”組織再生[1]。微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞在心肌內(nèi)存活、分化起決定性作用[2]。心肌梗死急性期心肌組織微環(huán)境突出表現(xiàn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial grow th factor, VEGF)、腫瘤壞死因子α和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等顯著增加以及氧化應(yīng)激反應(yīng)增加[3]。研究證實(shí)，AM I后VEGF分泌增加，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、趨化和遷移；還能動(dòng)員CD34陽(yáng)性細(xì)胞定向歸巢及轉(zhuǎn)化[4]。而CD34陽(yáng)性細(xì)胞的旁分泌作用可使其在歸巢后分泌一定量的VEGF。在AM I后心肌梗死局部微環(huán)境中CD34陽(yáng)性細(xì)胞與VEGF有一定的交互作用[5]。本次實(shí)驗(yàn)以CD34、VEGF為靶點(diǎn)對(duì)微環(huán)境影響AM I的治療進(jìn)行初步的探索。

在本課題組 “祛瘀血、生新血”為理論基礎(chǔ)的前期研究[6-7]下，把宏觀辨證與微觀辨證相結(jié)合，使用具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)作用的血塞通注射液(主要成分為三七總皂苷)作為中藥干預(yù)，以目前國(guó)際上主要使用的粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)作為心肌梗死后干細(xì)胞歸巢的有效動(dòng)員劑[8]，探討活血化瘀法治療AM I的效應(yīng)靶點(diǎn)及療效，為活血化瘀藥治療AM I提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)雄性Sprague-Daw ley大鼠48只，體質(zhì)量240～260 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥+ G-CSF組和G-CSF組。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥物、試劑

G-CSF：哈藥集團(tuán)生物工程有限公司；血塞通注射液：昆明制藥集團(tuán)股份有限公司；VEGF小鼠源性單克隆抗體、Ki-67山羊源性多克隆抗體、CD34小鼠源性單克隆抗體、CD34兔源性單克隆抗體：圣克魯斯；DAB免疫組化顯色試劑盒、山羊SP試劑盒、小鼠SP試劑盒：中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

急性心肌梗死模型的建立[8-9]：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d，以3%水合氯醛10m l/kg腹腔麻醉，仰面固定于鼠板，經(jīng)口氣管插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，有氧正壓通氣，呼吸頻率80次/m in，吸呼比1∶2，潮氣量5～6m l。經(jīng)左前胸廓旁第3、4肋間逐層開(kāi)胸，暴露心臟，分離心包，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處用5/ 0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(leftanterior descending,LAD)近端制成心肌梗死模型，結(jié)扎后觀察心臟數(shù)分鐘，可見(jiàn)左心室前壁顏色變蒼白、收縮力減弱即認(rèn)為造模成功，然后逐層縫合心腔。術(shù)后常規(guī)抗感染治療。

假手術(shù)組大鼠經(jīng)歷上述手術(shù)過(guò)程，絲線從冠狀動(dòng)脈下穿過(guò)但不結(jié)扎。

術(shù)后立即腹腔注射給藥，給藥量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》所示劑量換算法計(jì)算：大鼠劑量(g/kg)=成人的劑量[1 g/(kg·d)]×0.018。

G-CSF組每天注射G-CSF注射液5μl。中藥+ G-CSF組每天注射血塞通注射液2.5m l及G-CSF液5 μl。模型組及假手術(shù)組同上法注射等量的生理鹽水。每天1次，共用6 d。

1.4 病理形態(tài)學(xué)檢查

第7天各組處死大鼠，取心肌組織，切心臟最大橫徑，把下半部分進(jìn)行包埋。用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。在光鏡下進(jìn)行病理觀察。

1.5 免疫組化染色

連續(xù)給藥6 d，第7天各組處死大鼠，取出心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟浸水，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中抗原修復(fù)23 m in；取出靜止30 m in，恢復(fù)至室溫，PBS沖洗2 m in，共3次。

滴加1∶50稀釋的CD34、VEGF一抗(PBS做陰性對(duì)照)，放入濕盒，4℃過(guò)夜，PBS沖洗2min，共3次；滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG工作液(二抗)，37℃孵育15m in，PBS沖洗5m in，共3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(二抗)，37℃孵育15min，PBS沖洗5m in，共3次。

3%H2O2室溫避光孵育15m in，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗2m in，共3次；滴加1∶200稀釋的Ki-67一抗(PBS做陰性對(duì)照)，放入濕盒，4℃過(guò)夜，PBS沖洗2m in，共3次；滴加二抗工作液生物素標(biāo)記小鼠抗羊IgG工作液(二抗)，37℃孵育15min, PBS沖洗5m in，共3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(二抗)，37℃孵育15m in，PBS沖洗5m in，共3次。

DAB顯色劑顯色5m in，流水沖洗3次；蘇木素復(fù)燃，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片觀察。400倍光鏡下取4個(gè)視野，攝片，圖像分析軟件計(jì)算積分光密度值(IOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

32只大鼠造模成功，取8只作為假手術(shù)組，其余每組8只。

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

模型組梗死區(qū)室壁變薄，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)締組織整片廣布，成纖維細(xì)胞多，梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)充血及炎性細(xì)胞帶。中藥+ G-CSF組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，部分出現(xiàn)壞死，梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)炎性細(xì)胞帶。G-CSF組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，可見(jiàn)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞間偶見(jiàn)炎性細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 CD34陽(yáng)性細(xì)胞

心肌CD34陽(yáng)性細(xì)胞存在于胞漿，以心肌梗死邊緣區(qū)多見(jiàn)。模型組可見(jiàn)梗死區(qū)細(xì)胞溶解，假手術(shù)組未見(jiàn)梗死區(qū)。模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組心肌梗死邊緣區(qū)CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于假手術(shù)組(P＜ 0.05)；中藥+G-CSF組與G-CSF組均明顯高于模型組(P＜0.01)；中藥+G-CSF組高于G-CSF組(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組心肌梗死邊緣區(qū)CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(IOD)

2.3 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞

心肌VEGF陽(yáng)性細(xì)胞存在于胞漿，陽(yáng)性染色多數(shù)位于心肌梗死邊緣區(qū)，也有部分位于心肌內(nèi)膜區(qū)，考慮可能是由于時(shí)間窗的影響。假手術(shù)組有少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于假手術(shù)組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組、G-CSF組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于模型組(P＜ 0.05)；中藥+G-CSF組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著高于G-CSF組(P＜0.001)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組心肌梗死邊緣區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(IOD)

2.4 Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞

Ki-67抗體染色細(xì)胞核是反映處于細(xì)胞周期中增殖狀態(tài)細(xì)胞的理想標(biāo)志物[7]。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞染色顯示，模型組梗死區(qū)細(xì)胞漿溶解，但仍可見(jiàn)蘇木素復(fù)染的細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死區(qū)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少，Ki-67表達(dá)弱；模型組、中藥+G-CSF組、G-CSF組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組(P＜ 0.001)；中藥+G-CSF組與G-CSF組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于模型組(P＜0.05)；中藥+G-CSF組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于G-CSF組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

表3 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比

圖1 各組心肌組織HE染色(200×)

圖2 各組心肌組織CD34陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化染色(400×)

圖3 各組心肌組織VEGF陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化染色(400×)

圖4 各組心肌組織Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化染色(400×)

3 討論

在既往的研究中，可能有利于心肌微環(huán)境的構(gòu)成因素并不單一。在MRL小鼠鏈中，多個(gè)基因位點(diǎn)導(dǎo)致一些器官再生能力的提高。在這些小鼠中有時(shí)可以觀察到幾個(gè)有力的機(jī)制聯(lián)合在一起導(dǎo)致心臟再生能力的提高，包括血管形成和細(xì)胞增殖的增加，凋亡和纖維化的減少[11]。研究表明，AM I發(fā)生后，CD34陽(yáng)性細(xì)胞移植能促進(jìn)缺血、梗死的心肌細(xì)胞再生以及血管新生[12-14]。CD34陽(yáng)性細(xì)胞在向受損區(qū)域歸巢后，開(kāi)啟了可以滋養(yǎng)心肌細(xì)胞的旁分泌系統(tǒng)，即可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子如VEGF、腫瘤壞死因子α等，來(lái)調(diào)節(jié)損傷局部的微環(huán)境，刺激內(nèi)源性干細(xì)胞樣細(xì)胞/祖細(xì)胞的增殖和分化[15]，降低炎癥反應(yīng)[16-18]和免疫反應(yīng)[19]，從而促進(jìn)受損組織的再生修復(fù)能力。VEGF除了由歸巢干細(xì)胞的旁分泌功能產(chǎn)生以外，缺氧壞死的心肌組織細(xì)胞也可產(chǎn)生，并參與損傷后的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)。除此之外，VEGF還有通過(guò)動(dòng)員機(jī)體的干細(xì)胞參與心臟修復(fù)的功能[20]。CD34陽(yáng)性細(xì)胞與VEGF的交叉功能可視為強(qiáng)有力的聯(lián)合機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌梗死邊緣區(qū)存在大量CD34陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示以CD34陽(yáng)性細(xì)胞及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞作為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)梗死微環(huán)境，可以有效促進(jìn)修復(fù)。

結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的大鼠，血道閉塞血脈不通，瘀血阻滯脈絡(luò)，以 “血?dú)獠恢痢?、“血凝而不流”、“血瘀滯不行”等為主要病理機(jī)制，證型為心血瘀阻型[21]。既往的研究也為實(shí)驗(yàn)造模的大鼠具有急性心肌梗死心血瘀阻證的中醫(yī)證候特點(diǎn)提供了證據(jù)[8]。

本課題使用主要成分為三七總皂苷的血塞通作為中藥干預(yù)，取其活血祛瘀、通脈活絡(luò)之性，意在采取活血化瘀法隨證治之，使 “疏其氣血，令其條達(dá)”。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，模型組大鼠皮膚顏色蒼白、紫暗，活動(dòng)減少、活躍度降低。經(jīng)過(guò)藥物治療，中藥+ G-CSF組與其他組對(duì)比，大鼠皮膚顏色紅潤(rùn)，行為也比較活躍。中藥+G-CSF組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞染色、CD34陽(yáng)性細(xì)胞染色均高于G-CSF組(P＜0.05)。此結(jié)果驗(yàn)證了活血化瘀藥影響微環(huán)境對(duì)心臟的修復(fù)有促進(jìn)功能。

本實(shí)驗(yàn)采取活血化瘀法，一方面通過(guò)化瘀、化舊等方法來(lái)祛除體內(nèi)沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產(chǎn)物，另一方面強(qiáng)調(diào)活血、生血[22]。實(shí)驗(yàn)研究證明，具有活血祛瘀功效的牛膝精能促進(jìn)CD34陽(yáng)性細(xì)胞的增殖分化，考慮該作用可能與改善造血組織的微環(huán)境有關(guān)[23]。王宗仁等發(fā)現(xiàn)有益氣活血功能的芪丹通脈片能夠預(yù)防急性心肌缺血，刺激心肌分泌VEGF及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[24]。本實(shí)驗(yàn)中，中藥+G-CSF組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞多于G-CSF組，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。因此推測(cè)，以活血化瘀法影響CD34、VEGF來(lái)調(diào)整微環(huán)境促進(jìn)梗死心肌修復(fù)，具有一定意義的治療作用。AM I后微環(huán)境的其他作用靶點(diǎn)及從更深層次的基因?qū)用嬲撟C活血化瘀法的療效等值得更進(jìn)一步的研究。

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書(shū)訊

《特殊兒童教育與康復(fù)文庫(kù)》已由南京師范大學(xué)出版社出版。本文庫(kù)系國(guó)家出版基金項(xiàng)目、國(guó)家 “十二五”重點(diǎn)圖書(shū)出版規(guī)劃項(xiàng)目，由顧明遠(yuǎn)、張海迪任總顧問(wèn)，樸永馨、林寶貴、方俊明、勵(lì)建安、貝維斯、卓大宏等任各分冊(cè)學(xué)術(shù)顧問(wèn)，南京特殊教育師范學(xué)院丁勇任總主編，勵(lì)建安、李曉捷、陳小娟、許家成、杜曉新、黃冬、盛永進(jìn)、何侃等任分冊(cè)主編。

本文庫(kù)分為 “特殊兒童教育系列”與 “特殊兒童康復(fù)系列”兩個(gè)子系列共20分冊(cè)。“特殊兒童教育系列”包括《殘疾兒童權(quán)利與保障》《特殊兒童教育導(dǎo)論》《特殊兒童教育評(píng)估》《特殊兒童早期發(fā)展支持》《特殊兒童溝通與交往》《特殊兒童認(rèn)知訓(xùn)練》《特殊兒童行為管理》《特殊兒童生活教育》《特殊兒童體育與運(yùn)動(dòng)》《特殊兒童生涯發(fā)展與轉(zhuǎn)銜教育》?！疤厥鈨和祻?fù)系列”包括《特殊兒童康復(fù)概論》《特殊兒童物理治療》《特殊兒童作業(yè)治療》《特殊兒童語(yǔ)言與言語(yǔ)治療》《特殊兒童心理治療》《特殊兒童藝術(shù)治療》《特殊兒童舞動(dòng)治療》《特殊兒童功能性視力訓(xùn)練》（附DVD光盤(pán)）《特殊兒童定向行走訓(xùn)練》《特殊兒童輔助技術(shù)》。

本文庫(kù)倡導(dǎo)與心理、教育相結(jié)合的康復(fù)理念；強(qiáng)調(diào)家庭、社區(qū)、學(xué)校(康復(fù)機(jī)構(gòu))的配合協(xié)作；注重運(yùn)用多種手段進(jìn)行綜合康復(fù)，以幫助殘障兒童盡可能像健全兒童那樣學(xué)習(xí)和生活。圖文并茂，操作性強(qiáng)，適用面廣，讀者群大，可供各類、各級(jí)殘疾兒童教育機(jī)構(gòu)教育與研究工作者、各級(jí)康復(fù)機(jī)構(gòu)服務(wù)人員、殘疾兒童及其他特殊需要兒童家長(zhǎng)以及其他從事相關(guān)工作的人員參考。

精裝總定價(jià)：1200元(20冊(cè))，平裝總定價(jià)：880元(20冊(cè))?？偩庌k電話：025-83598919，營(yíng)銷部電話：025-83598712/83598412，郵購(gòu)部電話：025-83598297，網(wǎng)址：http://www.njnup.com，郵箱：nspzbb@163.com，聯(lián)系地址：南京市寧海路122-1號(hào)，郵政編碼：210097。

Effect of Activating Blood to Resolve Stagnation on Cells Expressing CD34and Vascular EndothelialGrow th Factor in Ratswith Acute Myocardial Infarction

SHIWei1,LIYe-zi2,ZHAOHai-bin2,YANG Dan-dan2,JIANG Tian-yuan2,LIDong-fang2,ZHAIYao-yao2
1.Health Bureau of Chaoyang District,Beijing 100026,China;2.Department of Cardiology,the Third A ffiliated Hospitalof Beijing University of ChineseMedicine,Beijing 100029,China

Objective To explore the effectof Activating Blood to Resolve Stagnation on the expression of CD34and vascular endothelialgrow th factor(VEGF)in ratswith acutemyocardial infarction.Methods32Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham operation group(A,n=8),model group(B,n=8),Xuesaitong Injection+granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)group(C,n=8)and G-CSF group(D,n=8).Correspondingmedicinewas given to each group 3 hours aftermodeling,for 6 days.Pathomorphological changes wereobserved through HE staining,and theexpression of CD34,VEGFand Ki-67wereobserved through immunohistochemicalstaining.Results The expressions of CD34,VEGF and Ki-67 were higher in groups B,C and D than in group A(P＜0.05),and were higher in group groups C and D than in group B(P＜0.05).The expressions of CD34and VEGFwere higher in group C than in group D(P＜0.05).However, therewasno significantdifference in the expression of Ki-67 between 2 groups(P＞0.05).Conclusion Theexpression of CD34and VEGF increaseswith Activating Blood to Resolve Stagnationmethod,which is superior to using G-CSF only.Activating Blood to Resolve Stagnationmay play an important role in the treatmentof acutemyocardial infarction.

acutemyocardial infarction;marrow stem cells;vascular endothelial grow th factor;micro environment;Activating Blood to Resolve Stagnationmethod

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.005

R541.4

A

1006-9771(2015)08-0894-06

2015-02-05

2015-04-27)

北京中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(No.JJ2011-67)。

1.北京市朝陽(yáng)區(qū)衛(wèi)生局，北京市100026；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，北京市100029。

師偉(1960-)，男，漢族，河北東光縣人，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向：疾病預(yù)防控制工作。通訊作者：趙海濱，男，博士，教授。E-mail:haibin999@126.com。