鹽酸多奈哌齊對血管性癡呆模型大鼠大腦NO及iNOS的影響

閆云峰 楊勁松

1）鄭州市直機關(guān)醫(yī)院內(nèi)科 鄭州 450000 2）鄭州大學(xué)實驗動物中心 鄭州 450052

鹽酸多奈哌齊對血管性癡呆模型大鼠大腦NO及iNOS的影響

閆云峰1）楊勁松2）

1）鄭州市直機關(guān)醫(yī)院內(nèi)科 鄭州 450000 2）鄭州大學(xué)實驗動物中心 鄭州 450052

目的 觀察鹽酸多奈哌齊（DP）對血管性癡呆模型大鼠iNOS表達的影響，探討其抗血管性癡呆的作用及機制。方法 將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、實驗對照組、DP治療組，每組大鼠20只，采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制作血管性癡呆大鼠模型。DP干預(yù)治療后，用“Y”型迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，比色法檢測大鼠大腦NO及NOS的表達。結(jié)果 與實驗對照組比較，DP治療后VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，海馬iNOS表達明顯減少（P＜0.01）。結(jié)論 鹽酸多奈哌齊可改善學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能是通過下調(diào)iNOS的過度表達，減少NO的生成，抑制神經(jīng)細胞損傷。

血管性癡呆；大鼠；iNOS；鹽酸多奈哌齊；學(xué)習(xí)；記憶

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的腦組織損害基礎(chǔ)上，產(chǎn)生的以高級神經(jīng)認知功能障礙為主的一組臨床綜合征［1］，是繼阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）后第二常見的癡呆類型。目前國內(nèi)外對VD尚無有效防治手段。鹽酸多奈哌齊（donepezil，DP）作為第二代膽堿脂酶抑制劑，通過可逆性非競爭地抑制乙酰膽堿脂酶和活性，改善記憶各認知功能，是目前治療老年癡呆的首選藥物，但其用于VD的治療機制尚不明確。本實驗通過觀察VD大鼠iNOS的表達，探討iNOS在DP治療VD大鼠認知障礙中所起作用及可能機制。

1 對象和方法

1.1 對象 篩選Y迷宮學(xué)習(xí)達標的10月齡健康雄性SD大鼠60只（體質(zhì)量250～280g），清潔級，動物隨機分為假手組、實驗對照組、DP治療組每組20只。DP治療組以水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉后行頸正中切口，仔細分離肌肉，分離出雙側(cè)頸總動脈并埋線結(jié)扎，縫合傷口。假手術(shù)組在手術(shù)中分離出雙側(cè)頸總動脈，埋線后將手術(shù)線抽出，然后縫合傷口。將DP 以0.1mg/mL用生理鹽水配制，DP治療組每天以1mg/kg的劑量灌胃，假手術(shù)組給予同等量生理鹽水灌胃。造模后30 d，應(yīng)用Y迷宮測試對各組大鼠進行學(xué)習(xí)記憶能力測試，每組隨機取10只大鼠進行免疫組化實驗，另取10只大鼠取腦組織制成腦組織勻漿液測定NO和iNOS含量。

1.2 方法

1.2.1 學(xué)習(xí)記憶能力測試：采用Y迷宮測試，選取錯誤反應(yīng)次數(shù)（error number，EN）及全天總反應(yīng)時間（total reaction time，TRT）作為觀察指標。

1.2.2 NO含量、iNOS活力測定：造模后第30天，各組大鼠用水合氯醛麻醉，取血后，快速剖出全腦，去除軟腦膜血管、腦干及小腦。稱質(zhì)量，放入低溫冰箱。用腦組織重量9倍的生理鹽水和腦組織放入勻漿機研碎，制成10％的腦組織勻漿液，3 000～4 000r/min離心10min，取上清液，嚴格按照NO含量、iNOS活性試劑盒的操作步驟進行測定。NO含量單位為微摩爾/克蛋白（μmol/gprot），iNOS活性定義為每毫克組織蛋白每分鐘生成的1nmol NO為一個單位，即nmol/min·mg。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率（％）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)對大鼠存活能力及運動能力的影響 各組大鼠在術(shù)后早期均出現(xiàn)運動減少，爬行時后肢呈“八”字，有共濟失調(diào)，轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，術(shù)后5～7d爬行基本恢復(fù)，無明顯運動障礙。假手術(shù)組活動多在3～5d后恢復(fù)正常，與假手術(shù)組大鼠相比，實驗對照組術(shù)后活動能力更差，DP治療組大鼠活動能力也差，但明顯強于實驗對照組。

2.2 手術(shù)對大鼠存活能力的影響 術(shù)后共死亡大鼠6只，其中，實驗對照組4只，DP治療組2只，其余各鼠生存良好。見表1。

表1 手術(shù)后大鼠死亡情況比較

2.3 手術(shù)對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 Y迷宮測試發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，實驗對照組大鼠全天錯誤次數(shù)增多，反應(yīng)時間明顯延長，與實驗對照組比較，DP治療組大鼠的全天錯誤次數(shù)減少，反應(yīng)時間明顯縮短，提示DP治療改善了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表2。

表2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，●P＜0.05；與DP治療組比較，★P ＜0.05

組別 n EN ERT假手術(shù)組20 1.312±0.541 91.987±8.160實驗對照組 16 6.062±1.245●★ 114.492±9.561●★DP治療組18 5.550±0.593 103.546±9.024

2.4 腦勻漿NO含量、iNOS活力測定結(jié)果 模型組大鼠腦組織NO含量和iNOS活力明顯高于假手術(shù)組，DP治療組大鼠腦組織NO含量和iNOS活力明顯低于模型組（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠NO含量、iNOS活力測定結(jié)果比較（±s）

表3 各組大鼠NO含量、iNOS活力測定結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，●P＜0.05；與DP治療組比較，★P＜0.05

組別 NO含量（μmol/gprot）iNOS活力（nmol·min-1·mg-1）假手術(shù)組1.349±0.3190 3.319±0.2470實驗對照組 2.3417±0.1868●★ 4.2837±0.3801●★DP治療組1.9478±0.2649 3.758±0.4260

3 討論

NO是在NOS的催化下，由L-精氨酸分解為L-瓜氨酸和NO而成。NOS可分為原生型NOS（cNOS）和誘生型NOS（iNOS）。cNOS以無活性狀態(tài)存在，腦缺血后造成神經(jīng)損傷的NO主要由iNOS產(chǎn)生。iNOS是一種可溶性酶，在生理情況下，iNOS并不表達，在病理條件下，細菌內(nèi)毒素及細胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白介素-1α（IL-1α）和干擾素γ（IFN-γ）誘導(dǎo)巨噬細胞以及其他細胞基因轉(zhuǎn)錄，啟動蛋白質(zhì)合成，iNOS持續(xù)激活［2］，產(chǎn)生大量NO。高濃度的NO可通過與過氧化物產(chǎn)生反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽是一種半衰期較長的強有力氧化劑，它比NO和過氧化物具有更強的細胞毒性，可使細胞蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷［3］；高濃度的NO與Fe結(jié)合，使Fe從酶中丟失而抑制酶的活性，由此阻斷細胞內(nèi)能量的合成和DNA復(fù)制，產(chǎn)生細胞毒性作用。由于iNOS受DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，故誘導(dǎo)數(shù)小時后才產(chǎn)生酶活力，一經(jīng)誘導(dǎo)，可長時間保持酶的活力［3］，故而iNOS被認為是一種“病理型”的酶。

研究表明，腦缺血后的神經(jīng)元損傷可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙，血管性癡呆是腦血管疾病后的并發(fā)癥，大量臨床研究證明，血管性癡呆發(fā)生的原因是由于一次或多次的腦梗死或其他腦血管病變造成足夠的腦組織損害所致，病理檢查已經(jīng)證實腦血管疾病患者有足夠的腦組織損害才能產(chǎn)生癡呆。

結(jié)果顯示，術(shù)后30d對照組出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，表現(xiàn)為全天錯誤次數(shù)增多，反應(yīng)時間明顯延長，而DP治療組則學(xué)習(xí)記憶成績明顯好于對照組，表明DP能改善學(xué)習(xí)記憶能力。其機制可能與DP抑制iNOS表達，降低iNOS的活性，從而減少NO的生成，對缺血所致的NO增加有一定的拮抗作用，促進受損神經(jīng)元逆向恢復(fù)，保護可以受損的神經(jīng)元，減少其功能喪失，改善癡呆者的學(xué)習(xí)記憶能力。

［1］Paul RH，Cohen RA，Moser DJ，et al.Clinical correlates of cognitive decline in vascular dementia［J］.Cogn Behav Neurol，2003，16（1）：40-46.

［2］Knowles RG，Moncada S.Nitric oxide synthases in mammals［J］.Biochem，1994，298（Pt2）：249-258.

［3］Fukuyama N，Takizawa S，ishida H，et al.Peroxynitrite formation in focal cerebral iachemia-reperfusion in rats occurs predominantly in periinfarct region.［J］Cereb Blood Flow Metal，1998，18（2）：123-129

（收稿2014-05-13）

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1673-5110（2015）05-0070-02