丙戊酸代謝相關CYP2C19基因多態(tài)性在癲癇患兒體內的分布及治療個體化研究

馮亞娟 周建華 劉科蘭 吳干斌

鄭州大學第二附屬醫(yī)院西藥學部 鄭州 450014

丙戊酸代謝相關CYP2C19基因多態(tài)性在癲癇患兒體內的分布及治療個體化研究

馮亞娟 周建華 劉科蘭 吳干斌△

鄭州大學第二附屬醫(yī)院西藥學部 鄭州 450014

目的 對癲癇患兒體內CYP2C19的基因多態(tài)性進行研究，并進行基因型與患兒體內丙戊酸血藥濃度關系的研究，以對患兒進行治療個體化。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性檢測技術對2012-12—2014-03來我院及其他醫(yī)院神經內科654例確診為癲癇患兒的CYP2C19基因型進行檢測，同時對僅服用丙戊酸進行抗癲癇治療的228例患兒體內的丙戊酸穩(wěn)態(tài)血藥濃度進行檢測，進而探求CYP2C19的基因型與血藥濃度的相關性。結果 CYP2C19具有基因多態(tài)性，各基因型分布頻率不同，其中＊1/＊1型為41.9％、＊1/＊2型為41.1％、＊1/＊3型為6.4％、＊2/＊2型為7.4％、＊2/＊3型為2.9％和＊3/＊3型為0.3％；同時入選組的228例患兒中快、中、慢代謝型所占的頻率分別為40.8％、44.7％和13.5％；同時測得＊1/＊1型、＊1/＊2型、＊1/＊3型、＊2/＊2型、＊2/＊3型所對應的穩(wěn)態(tài)血藥濃度（mg/L）分別為45±20、64±16、68±21、73±28、72±18；經統(tǒng)計分析發(fā)現，＊2/＊2型與＊1/＊1型血藥濃度體質量劑量比值存在差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 癲癇患兒體內CYP2C19具有多態(tài)性，其分布規(guī)律與其他正常人群的分布規(guī)律基本一致，患兒服用丙戊酸時，其CYP2C19基因型與體內丙戊酸的血藥濃度具有相關性。因此提醒我們，對癲癇患兒應用丙戊酸進行抗癲癇治療時，可參考CYP2C19基因分型結果，預測血藥濃度變化，對患兒進行個體化的治療。

CYP2C19；基因多態(tài)性；癲癇患兒；丙戊酸；血藥濃度

癲癇是慢性反復發(fā)作性短暫腦功能失調綜合征，以腦神經元異常放電引起反復癇性發(fā)作為特征，具有發(fā)病率高、療程長、治愈率低特點。臨床治療中主要以長期合理使用抗癲癇藥物為主。小兒癲癇發(fā)病率高，可達到2％～7％。

丙戊酸是臨床常用的廣譜抗癲癇藥物，但其血藥濃度、療效和不良反應存在顯著的個體差異，因此在臨床應用中需要對患者進行血藥濃度監(jiān)測（TDM）。同時在使用過程中發(fā)現有“耐藥”現象的產生。研究表明，CYP2C19在體內可參與丙戊酸的代謝過程，其多態(tài)性會影響到體內血藥濃度的高低，進而影響藥物的療效，與“耐藥”現象的產生有關［1-4］。本文擬通過對癲癇患兒的CYP2C19基因多態(tài)性進行研究，進而探求基因多態(tài)性與患兒體內丙戊酸血藥濃度的相關性，從而為癲癇患兒提供個體化給藥方案。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 DNA提取及擴增試劑盒，有上海某公司提供；ABI9902型PCR擴增儀，美國AB公司生產；BR526-24型全自動雜交儀，上海某公司生產；BE-2.0型生物芯片識別儀，上海某公司生產；5424R型高速離心機，德國eppendorf公司生產；HYC-260型醫(yī)用冷藏箱，青島海爾公司生產；TDX SYSTEM型快速血藥濃度檢測儀，美國雅培公司生產；其余耗材及試劑均為國產

1.2 研究對象 研究對象是2012-12—2014-03來我院及其他醫(yī)院神經內科確診為癲癇的654例患兒，均簽署知情同意書，漢族，彼此之間無血緣關系。年齡3個月～12歲，男448例，女206例，否認癲癇家族史。入組行基因型和丙戊酸血藥濃度相關性研究的患兒（由上述654例患兒中選出）標準是：僅為癲癇患兒，無其他并發(fā)癥，單獨使用丙戊酸，無聯合用藥，肝腎功能無異常，取血時間為建立穩(wěn)態(tài)血藥濃度時；剔除標準為：合并其他病癥，存在聯合用藥現象，肝腎功能異常，取血時間點不規(guī)范。入組進行相關性研究的癲癇患兒228例，年齡6個月～12歲，男164例，女64例，平均年齡（5.0±4.1）歲，平均體質量（16.5±11.3）kg，服用丙戊酸的劑量平均值（375±235）mg/d。

1.3 研究方法

1.3.1 提取DNA：取654例癲癇患兒的外周血1mL（EDTA抗凝），提取試劑有上海某公司提供，按照相關操作流程進行DNA提取。

1.3.2 PCR擴增：反應體系25μL：擴增液和反應液共計20 μL，DNA模板5μL；PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；再在72℃條件下延伸5min，擴增產物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 分析CYP2C19基因型：根據基因多態(tài)性對藥物的代謝能力的強弱，將患者分為三種：弱代謝型（PM，雙位點突變型）；中間代謝型（IM，單位點突變型）；強代謝型（EM，野生純合子型）。其中強代謝型的基因型為＊1/＊1型；中間代謝型的基因型為＊1/＊2和＊1/＊3型；弱代謝型的基因型為＊2/＊2、＊2/＊3和＊3/＊3型［5］。有上海某公司提供的全自動雜交儀將PCR擴增產物進行雜交，應用單堿基延伸結合微陣列芯片法對位點進行檢測和測序，最終通過生物芯片識別儀讀出CYP2C19（636、681位點）的基因分型。

1.3.4 測定丙戊酸鈉血藥濃度：228例癲癇患兒服用丙戊酸5個半衰期，體內藥物濃度達到穩(wěn)態(tài)后，于下次用藥前抽取靜脈血，熒光偏振免疫法測定丙戊酸血藥濃度。為了避免丙戊酸劑量以及患兒體質量對血藥濃度的影響，我們對血藥濃度進行了標準化處理：將實驗測定的血藥濃度除以患者每日每公斤體質量的服藥劑量（血藥濃度/體質量劑量）。

1.4 統(tǒng)計學分析 用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析，利用χ2檢驗和方差分析對各組進行比較；同時進行Hardy—Weinberg定律的吻合度測驗，檢驗各等位基因頻率是否符合遺傳學規(guī)律［6］；并對基因型和體內血藥濃度的相關性進行統(tǒng)計學分析；所有檢測均雙側檢驗，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因型及其分布概率 我們對654例癲癇患兒體內CYP2C19的第636位和第681位兩個位點堿基的突變進行檢測，基因型圖示如圖1所示，另6種基因型在654例癲癇患兒中的各自分布頻率見表1。

圖1 CYP2C19各基因型生物芯片識別圖

表1 654例癲癇患兒體內CYP2C19各基因型的分布頻率

經過統(tǒng)計分析發(fā)現等位基因頻率在性別間無統(tǒng)計學意義（χ2＝2.76，P＞0.05）。通過計算檢測符合Hardy-Weinberg平衡定律，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 入組進行基因型與丙戊酸血藥濃度相關性研究 228例癲癇患兒體內CYP2C19各基因型分布頻率經過統(tǒng)計分析同樣發(fā)現等位基因頻率在性別間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝2.35，P＞0.05），同時和654例患者的基因型的分布概率相比，差異無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表2 入組相關性研究的228例癲癇患兒體內CYP2C19各基因型的分布頻率

2.3 CYP2C19各基因型與體內丙戊酸血藥濃度的關系

由于入選組樣本量偏小（僅228例），我們經過整理沒有發(fā)現＊3/＊3型（636AA，681GG）的患兒，各基因型血藥濃度及血藥濃度/體質量劑量結果見表3。結果中我們看到＊2/＊2型（636GG，681AA）（突變型）血藥濃度體質量劑量比值明顯高于＊1/＊1型（636GG，681GG）（野生型），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各基因型與血藥濃度的關系

3 討論

丙戊酸是臨床上常用的抗癲癇藥物之一，由于它抗癲譜比較廣，療效比較確切，價格比較低廉，因此在小兒癲癇患者中得到了廣泛的應用。但在臨床中發(fā)現服用該藥后體內的血藥濃度存在很大的個體差異，對于很多患者會出現消化系統(tǒng)、肝臟及血液系統(tǒng)的毒性，甚至出現致死性肝壞死（兩歲以下患兒多見）［7］。鑒于個體差異等方面的原因，在使用上述藥物進行抗癲癇治療時需要進行血藥濃度監(jiān)測。

隨著藥物基因組學的發(fā)展，研究發(fā)現臨床中常用的抗癲癇藥物丙戊酸主要經CYP2C19代謝［1，8-90］。CYP2C19又稱為S-美芬妥英羥化酶，其存在基因多態(tài)性，會導致其活性存在明顯的個體差異，影響著很多藥物的代謝［10-13］。

我們對654例癲癇患兒體內CYP2C19的第636位（G→A突變）和第681位（G→A突變）兩個位點堿基的突變進行研究，結果發(fā)現，CYP2C19基因具有多態(tài)性，在癲癇患兒中發(fā)現有6種基因分型，各基因型分布概率與其他正常人群中的分布概率基本一致［14-16］。在癲癇患兒中，強代謝型（EM）的分布概率為41.9％，中間代謝型（IM）為47.5％，弱代謝型（PM）為10.6％。其中對于強代謝型與文獻報道的45.7％為低，中間型與文獻報道的38.3％較高，而對于弱代謝型與文獻報道的16.0％為低［16］。從本文的結果來看，有58.1％的癲癇患兒體內CYP2C19的基因存在缺陷（發(fā)生單突變或雙突變），也就是說有近六成的癲癇患兒在服用常規(guī)劑量的丙戊酸進行抗癲癇治療時，會因為血藥濃度升高而引起很多方面的不良反應，該數據與一篇文獻［17］報道的56.9％接近。

通過研究CYP2C19基因型和患兒體內丙戊酸血藥濃度的相關性我們發(fā)現，各基因型的患兒體內丙戊酸的血藥濃度有很大的差異，各基因型中，野生型的血藥濃度最低，高低順序為＊1/＊1型（636GG，681GG）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊2/＊2型（636GG，681AA）。而血藥濃度/體質量劑量的順序為＊1/＊1型（636GG，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＊2/＊2（636GG，681AA），這與文獻報道的相一致［17-20］。結果與國內外研究CYP2C19基因突變后血液中抗癲癇藥物如丙戊酸、苯巴比妥、苯妥英的濃度均會升高的結論是一致的。由于入組的樣本量較小，我們只發(fā)現了五種基因型，而未發(fā)現＊3/＊3型（636AA，681GG）。鑒于初步的研究結果，我們下一步擬對癲癇患兒的體質量劑量和血藥濃度分階段進行比較，并擴大樣本量進行試驗，以期獲得基因型和血藥濃度之間更為確切的相關性。

從本實驗的結果來看，服用標準劑量的丙戊酸后弱代謝型和中間代謝型患兒的丙戊酸血藥濃度均高于強代謝型患兒，這就提示我們在對患兒進行抗癲癇治療之前可以對患兒CYP2C19基因型進行檢測，對于CYP2C19基因型存在突變的癲癇患兒，可以使用較小劑量的丙戊酸，以期達到控制癲癇發(fā)作同時減少不良反應發(fā)生的目的，進而為癲癇患兒實現真正意義上的個體化用藥。

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（收稿2014-06-12）

R742.1

A

1673-5110（2015）05-0049-04

河南省教育廳科學技術研究重點項目（14A350014）

△通訊作者：吳干斌，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學。

E-mail：wganbin521＠sina.com