桉樹提取物與苯唑西林對MRSA的抗菌作用

崔海英 張雪婧 周 慧 趙呈婷 李 偉 林 琳

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）尤為重要［1］。隨著抗菌藥物種類的不斷增多及抗菌藥物的不合理使用，在臨床感染金黃色葡萄球菌的病例中，MRSA所占的比例越來越高［2］。MRSA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，其主要機(jī)制是獲得編碼低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因，從而表現(xiàn)出對甲氧西林、苯唑西林及其他β－內(nèi)酞胺類抗生素耐藥［3］。它的多重耐藥性給臨床診療和院內(nèi)感染控制帶來非常大的困難，因此，MRSA的防治工作十分嚴(yán)峻［4］。

桉樹葉可以提煉揮發(fā)油，具有較強(qiáng)的抗菌、消炎、防腐及殺蟲驅(qū)蚊等作用，在食品、化工、醫(yī)藥、能源等方面有著廣泛的用途。而桉樹又是世界上三大速生豐產(chǎn)樹種之一［5］，因此，桉樹葉在抑菌方面具有極大的開發(fā)利用潛力。

盡管桉樹葉提取物和苯唑西林各自都有著良好的抗菌殺菌作用。但是，怎樣降低用藥量，提高殺菌效率，鮮有人研究。因此，本研究擬通過比較桉樹提取物與苯唑西林對MRSA的抗菌作用，探索桉樹提取物與苯唑西林的協(xié)同作用，及其降低MRSA耐藥性的作用機(jī)制，從而為克服MRSA對苯唑西林的耐藥性打下基礎(chǔ)，也為開發(fā)桉樹植物抗菌劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

供試菌種：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）No.11、No.16、No.23、No.36、No.38、B-26、11D1677，由日本廣島大學(xué)提供；

苯唑西林：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PBP2’膠乳凝集試劑盒：日本Deka2Seiken公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

M-H瓊脂培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白17.5g/L，牛肉浸膏粉2g/L，淀粉1.5g/L，瓊脂12g/L。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋：MLS-3020型，鳥取三洋電機(jī)（廣州）有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-250型，上海恒一科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)成分的提取方法

（1）桉樹葉洗凈，剪切，烘干，用無水乙醇浸泡提取，桉葉與乙醇質(zhì)量比例為1∶9，浸泡48h。過濾取得濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸掉無水乙醇，即得到桉樹乙醇提取物［6］。

（2）桉樹葉洗凈，剪切，烘干，用蒸餾水浸泡加熱提取，桉葉與蒸餾水質(zhì)量比例為1∶9，加熱溫度為100℃，加熱1 h，過濾取得濾液，再用過濾滅菌法將濾液滅菌，得到濃度為10%的桉樹水提取物［6］。

1.2.2 桉樹提取物對7種MRSA的MIC測定 在無菌的培養(yǎng)皿里加入添加了40g/L NaCl的M-H瓊脂培養(yǎng)基與桉樹乙醇提取物或桉樹水提取物，使得桉樹乙醇提取物或桉樹水提取物的濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0g/L；用劃線接種法接種各種前培養(yǎng)的MRSA，于35℃靜止培養(yǎng)48h，根據(jù)各培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長痕跡來確定MIC的濃度。

1.2.3 苯唑西林對7種MRSA的MIC測定 苯唑西林鈉一水合物用蒸餾水溶解，溶解濃度為10g/L，用過濾滅菌法滅菌。在無菌的培養(yǎng)皿里加入添加了40g/L NaCl的 M－H瓊脂培養(yǎng)基與苯唑西林鈉溶液，使苯唑西林的濃度為31.3，62.5，125.0，250.0，500.0mg/L。用劃線接種法接種各種前培養(yǎng)的MRSA，于35℃靜止培養(yǎng)48h，根據(jù)各培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長痕跡來確定MIC的濃度。

1.2.4 桉樹提取物與苯唑西林共同作用對7種 MRSA的抗菌活性 苯唑西林鈉一水合物用蒸餾水溶解，溶解濃度為10g/L，用過濾滅菌法滅菌［7］。在無菌的培養(yǎng)皿里加入添加了40g/L NaCl的M-H瓊脂培養(yǎng)基之后，添加苯唑西林鈉溶液，使苯唑西林鈉的濃度為3.9，7.8，15.6，31.3，62.5，125.0，250.0mg/L，再分別添加0.2g/L的桉樹乙醇提取物與1.0g/L的桉樹水提取物。用劃線接種法接種各種前培養(yǎng)的MRSA。于35℃靜止培養(yǎng)48h，根據(jù)各培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長痕跡來確定MIC的濃度。

1.2.5 利用FIC index法測定桉樹提取物與苯唑西林對7種MRSA的協(xié)同效應(yīng) 苯唑西林鈉一水合物用蒸餾水溶解，溶解濃度為10g/L，用過濾滅菌法滅菌。在無菌的培養(yǎng)皿里加入添加了40g/L NaCl的 M-H瓊脂培養(yǎng)基之后，添加苯唑西林溶液，使苯唑西林的濃度為3.9，7.8，15.6，31.3，62.5，125.0，250.0mg/L，再分別添加0.2g/L的桉樹乙醇提取物與1.0g/L的桉樹水提取物。用劃線接種法接種各種前培養(yǎng)的MRSA。于35℃靜止培養(yǎng)48h，根據(jù)各培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長痕跡來確定MIC的濃度。

桉樹提取物與苯唑西林的協(xié)同效果采用測定分級抑制濃度指數(shù)［fractional inhibitory concentration（FIC）index］法來進(jìn)行評價［8］，其計算方法為：

式中：

FIC index——分級抑制濃度指數(shù)；

m1——并用時桉樹提取物的 MIC，g/L；

m2——單獨(dú)使用時桉樹提取物的 MIC，g/L；

m3——并用時苯唑西林的 MIC，mg/L；

m4——單獨(dú)使用時苯唑西林的 MIC，mg/L。

FIC index≤0.5，協(xié)同效果；0.5＜FIC index≤1.0，相加效果；1.0＜FIC index≤2.0，無效果；FIC index＞2.0，拮抗效果。

1.2.6 桉樹提取物降低 MRSA耐藥性的作用機(jī)制 采用MRSA乳膠凝集法探索桉樹提取物降低MRSA耐藥性的作用機(jī)制，即使用PBP2’膠乳凝集試劑盒來測定PBP2’的產(chǎn)生，并采用包被有抗PBP2a單克隆抗體的乳膠顆粒與生長于血平板上純的金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行凝集試驗(yàn)。即在無菌M-H液體培養(yǎng)基里，添加2.0g/L的桉樹乙醇提取物與前培養(yǎng)的試驗(yàn)菌，于35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液用pH 7無菌磷酸生理鹽水緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗3次，再加200μL 0.1MNaOH使沉淀懸浮，其金黃色葡萄球菌的細(xì)胞數(shù)為109Cells/200μL，懸浮液加熱3min，使菌體釋放PBP2’，再添加50μL的 KH2PO4，進(jìn)行離心（3 000r/min，5 min）。載玻片上各滴入50μL上清液的原液、2倍、4倍以及8倍稀釋液，再添加25μL的抗PBP2’單克隆抗體攪拌，反應(yīng)3min，觀察有沒有凝集現(xiàn)象。結(jié)果判斷根據(jù)說明書，分3＋，2＋，＋，－的4個層次表示凝集程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹提取物對7種MRSA的MIC測定

本試驗(yàn)的桉樹提取物對7種院內(nèi)感染病原菌——MR-SA顯示了良好的抑菌效果（表1）：桉樹乙醇提取物和桉樹水提取物對7種MRSA的MIC分別為2～5g/L和5g/L，桉樹乙醇提取物為佳。

表1 桉樹提取物對各種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性Table 1 Inhibition effect of Eucalyptus Extract against MRSA

2.2 青霉素類抗生素苯唑西林對7種MRSA的MIC測定

由表2可知：苯唑西林對7種MRSA的抑菌濃度范圍為62.5～250.0mg/L。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)［9，10］，苯唑西林 MIC≥4μg/mL為耐藥，即所有的試驗(yàn)菌對苯唑西林均顯示了很強(qiáng)的耐藥性。

表2 苯唑西林對各種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性Table 2 Inhibition effect of oxacillin against MRSA

2.3 桉樹提取物與苯唑西林共同作用對7種 MRSA的MIC

由圖1可知，苯唑西林對7種MRSA的最小抑菌濃度范圍為62.5～250.0mg/L，而添加0.02%的桉樹乙醇提取物之后，苯唑西林對7種MRSA的最小抑菌濃度范圍減小至7.8～31.3mg/L，添加0.1%的桉樹水提取物之后，苯唑西林對7種MRSA的最小抑菌濃度范圍，除了試驗(yàn)菌株MRSA No.16，均減小至7.8mg/L，而 MRSA No.16的最小抑菌濃度從250.0mg/L減小至62.5mg/L，以上結(jié)果，充分證明桉樹乙醇提取物與水提取物明顯減小MRSA對苯唑西林的耐藥性，二者顯示了良好的協(xié)同效果。

圖1 桉樹提取物與苯唑西林共同作用對7種MRSA的MICFigure 1 MIC of eucalyptus extract in combination with oxacillin of MRSA

2.4 利用FIC index法測定桉樹提取物與苯唑西林對7種MRSA的協(xié)同效應(yīng)

由表3可知，添加0.05%（1/4MIC）的桉樹乙醇提取物，可使苯唑西林的最小抑菌濃度范圍從62.5～250.0mg/L降低至0.49～0.98mg/L，其分級抑制濃度指數(shù)為0.11～0.26，即小于0.5，顯示了協(xié)同效應(yīng)，添加0.2g/L（1/10MIC）的桉樹乙醇提取物時，分級抑制濃度指數(shù)為0.13～0.60，除No.11之外均顯示了良好的協(xié)同效應(yīng)。同樣，如表6所示，添加1.0g/L（1/5MIC）和0.5g/L（1/10MIC）的桉樹水提取物時，其分級抑制濃度指數(shù)分別為0.20～0.26，0.13～0.60，顯示了良好的協(xié)同效應(yīng)。

表3 桉樹乙醇提取物與苯唑西林對MRSA的FIC indexTable 3 FIC index of ethanol extract of eucalyptus in combination with oxacillin of MRSA

表3 桉樹乙醇提取物與苯唑西林對MRSA的FIC indexTable 3 FIC index of ethanol extract of eucalyptus in combination with oxacillin of MRSA

桉樹乙醇提取物對MRSA的MIC為2.0g/L。

FIC index 0.5g/L 0.2g/L 0.1g/L 0.05g/L No.11 250.00 0.98 125.00 125.00 250.00 0.25 0.60 0.55 1.03 No.16 250.00 0.49 62.50 125.00 250.00 0.25 0.35 0.55 1.03 No.23 125.00 0.49 7.82 7.82 62.50 0.25 0.16 0.11 0.53 No.36 62.50 0.49 1.95 3.91 15.60 0.26 0.13 0.11 0.28 No.38 125.00 0.49 3.91 62.50 125.00 0.25 0.13 0.55 1.03 B-26 62.50 0.49 7.82 15.60 31.25 0.11 0.17 0.27 0.51 11D1677 125.00 0.49 31.30 62.50 125.00 0.25 0.35 0.55 1.03試驗(yàn)菌苯唑西林的 MIC/（mg·L－1）0（對照） 0.5g/L 0.2g/L 0.1g/L 0.05g/L

表4 桉樹水提取物與苯唑西林對MRSA的FIC indexTable 4 FIC index of water extract of eucalyptus in combination with oxacillin of MRSA

表4 桉樹水提取物與苯唑西林對MRSA的FIC indexTable 4 FIC index of water extract of eucalyptus in combination with oxacillin of MRSA

桉樹水提取物對MRSA的MIC為5.0g/L。

試驗(yàn)菌苯唑西林的 MIC/（mg·L－1）0（對照） 1.0g/L 0.5g/L 0.2g/L 0.1g/L FIC index 1.0g/L 0.5g/L 0.2g/L 0.1g/L.60 1.04 1.02 35 1.04 1.02 No.16 250.00 1.95 62.50 250.00 250.00 0.21 0.35 1.04 1.02 No.23 125.00 1.95 7.82 125.00 125.00 0.22 0.16 1.04 1.02 No.36 62.50 0.49 1.95 62.50 62.50 0.21 0.13 1.04 1.02 No.38 125.00 0.49 7.82 125.00 125.00 0.20 0.16 1.04 1.02 B-26 62.50 3.91 3.91 62.50 62.50 0.26 0.16 1.04 1.02 11D1677 125.00 7.82 62.50 125.00 125.00 0.26 0 No.11 250.00 15.60 62.50 250.00 250.00 0.26 0.

2.5 桉樹提取物降低MRSA耐藥性的作用機(jī)制

由表5可知，對7個供試菌株，對照樣品均顯示了很強(qiáng)的凝集反應(yīng)。添加2g/L桉樹乙醇提取物的樣品，從原液到稀釋至8倍，均顯示了較弱的凝集反應(yīng)。PBP2＇（penicillinbinding protein2＇）是葡萄球菌中的肽聚糖合成酶，是一種青霉素結(jié)合蛋白2（PBP2’），該蛋白的存在是細(xì)菌對β－內(nèi)酰胺類耐藥的主要根源。

表5 桉樹乙醇提取物對MRSA產(chǎn)PBP2’的影響Table 5 Impact of ethanol extract of eucalyptus on the produce of PBP2’of MRSA

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對比桉樹提取物與苯唑西林對7種MRSA的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)桉樹提取物顯示了更好的抗菌效果，其中桉樹的乙醇提取物，比水提取物具有更強(qiáng)的抗菌效果。而加入桉樹提取物的苯唑西林能夠明顯減弱MRSA對其耐藥性，試驗(yàn)也接著證明了桉樹提取物與苯唑西林確實(shí)有著良好的協(xié)同作用。

桉樹提取物降低MRSA耐藥性的作用機(jī)制是桉樹提取物抑制青霉素結(jié)合蛋白2（PBP2’）的合成，從而降低 MRSA對苯唑西林的耐藥性。這為MRSA的臨床診療和院內(nèi)感染控制提供了新的途徑，同時也為桉樹植物類抗菌劑開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域。

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