超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜水果中亞胺唑殘留量

陳景春 陳 盛 何亞斌 鄭小平

（上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海 200436）

亞胺唑（imibenconazole），是一種新三唑類殺菌劑，能有效防治子囊菌、擔子菌和半知菌所致的柑橘瘡痂病、葡萄黑痘病、梨黑星病等［1］。亞胺唑噴到作物上后能快速滲透到植物體內(nèi)，耐雨水沖刷，在推薦劑量下使用，對環(huán)境、作物安全，在蔬菜、果樹、禾谷類等作物的種植生產(chǎn)中被廣泛應用。亞胺唑在弱堿性條件下穩(wěn)定，在酸性和強堿性條件下不穩(wěn)定，對光穩(wěn)定。在雨水沖刷，土壤轉運的過程中，易污染地表水及水生動植物。人攝入后，可能導致神經(jīng)性，甚至遺傳性中毒。亞胺唑原藥急性口服毒性：大鼠LD50為0.80g/kg，小鼠的LD50大于5.00g/kg［2］。GB/T 2763—2014《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了：柑橘和蘋果的限量為1mg/kg，青梅和葡萄中限量為3mg/kg，但是無任何推薦使用的檢測標準。

目前，用于測定亞胺唑的方法主要有氣相色譜法［2－5］和高效液相色譜法［6－8］。但是由于氣相色譜及液相色譜都是通過目標物在分析中的保留時間來定性，并不能準確地區(qū)分干擾物及目標物。UPLC—MS/MS結合了LC的強大的分離分析能力和MS靈敏的鑒定及結構解析能力，提供了可靠、精確的相對分子質(zhì)量及結構信息，簡化了試驗步驟，同時節(jié)省了樣品準備時間和分析時間，GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》中就利用UPLC—MS/MS的這一優(yōu)勢，同時對450種農(nóng)藥進行了分析。為了更高效地測定蔬菜水果中亞胺唑殘留量，本研究擬通過固相萃取進行凈化，采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC—MS/MS）旨在為檢測亞胺唑含量提供更高的選擇性和靈敏度［9，10］。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮：色譜純，美國西格瑪公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用水為去離子水；

亞胺唑標準物質(zhì)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；

弗羅里硅土（Florisil）固相萃取柱：500mg/6mL，美國沃特世公司。

1.2 儀器設備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ型，美國沃特世公司；

分析天平：ML104型，瑞士梅特勒—托利多公司；

高速冷凍離心機：HeraeusMultifuge X1R型，美國熱電公司；

漩渦振蕩器：TALBOYS型，上海安譜科學儀器有限公司；氮吹儀：DSY-Ⅲ型，北京東方精華苑科技有限公司。

1.3 標準溶液配制

儲備液的配制：準確稱取5.00mg的標準品至50mL容量瓶中，用甲醇溶液配制成0.1mg/mL的標準貯備溶液，于4℃冰箱中保存。

1.4 樣品制備

準確稱取10.00g樣品，置于50mL離心管中，加入20 mL乙腈，均質(zhì)1min，加入5～8g氯化鈉，蓋緊瓶蓋于漩渦振蕩器上混勻，于4℃，8 000r/min離心5min，取上層有機相于100mL梨形瓶中；于殘渣中再加入20mL乙腈，混勻后于4℃，8 000r/min離心5min，取上層有機相合并入100 mL梨形瓶中，40℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干，加入5mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）溶解殘渣，待凈化用。

將Florisil固相萃取小柱用10mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）預淋洗活化，加入上述待凈化溶液，用50mL梨形瓶接收洗脫液，加入25mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）沖洗100mL梨形瓶后淋洗Florisil固相萃取小柱，收集洗脫液，40℃旋轉蒸發(fā)至近干。用1mL甲醇—水（5∶5，V/V）溶液溶解，經(jīng)0.22μm的有機相濾膜過濾，待上機分析。

1.5 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（1.7μm，2.1mm ×100 mm）；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈（梯度條件見表1）；流速為0.3mL/min；進樣體積：5μL；柱溫：40℃。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：1.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑流量：800L/h；脫溶劑溫度：400℃；定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 The elution conditions of mobile phase

表2 測定亞胺唑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The MS parameters for detecting Imibenconazole

2 結果與討論

2.1 凈化方法的確定

根據(jù)化學性質(zhì)，亞胺唑易溶于甲醇、乙腈、苯、二甲苯、丙酮中，在水中的溶解度較低。乙腈作為一種通用的提取溶劑在殘留檢測方面得到廣泛的應用，由于其與蛋白質(zhì)、脂肪類化合物難溶，對絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率，本試驗結果表明乙腈適合作為蔬菜水果中亞胺唑的提取試劑。在提取液中加入氯化鈉，增加水的比重與保證乙腈分層，再經(jīng)固相萃取凈化，可以得到滿足凈化要求的樣品。選用C18固相萃取柱和Florisil固相萃取柱以及石墨碳黑固相萃取柱進行凈化比較，結果表明，亞胺唑在C18固相萃取柱和石墨碳黑固相萃取柱中有吸附，雖然選用石墨碳黑固相萃取柱能更有效地去除樣品中的色素，但目標物也會同時被吸附，柱效回收率在60%左右。選擇Florisil固相萃取柱進行濃縮凈化后，干擾較低，回收率高。因此，本試驗選擇Florisil固相萃取柱進行凈化。

2.2 儀器條件的確定

圖1 亞胺唑標準品圖譜Figure 1 The UPLC—MS/MS of Imibenconazole

亞胺唑標準品圖譜見圖1。本試驗采用乙腈水溶液（0.1%甲酸）作為流動相；流動相中加入0.1%甲酸，增加了目標化合物在噴霧之前的離子化程度，提高了檢測的靈敏度；由于亞胺唑極性較小，在流動相梯度上選擇較高比例的有機相來保證目標化合物的完全洗脫。

2.3 線性關系及檢出限

準確移取亞胺唑儲備液適量，用不同基質(zhì)稀釋成一系列的標準工作液，其濃度分別為1.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg/L。以標準溶液中被測組分峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明（見表3）：亞胺唑在這些基質(zhì)中在1.0～100.0μg/L范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)r大于0.998。當亞胺唑添加濃度為1.0μg/kg時，測得質(zhì)譜峰信噪比S/N＞3，亞胺唑添加濃度為3.0μg/kg時，測得質(zhì)譜峰信噪比S/N＞10，則該方法檢出限為1.0μg/kg，定量限為3.0μg/kg。

2.4 方法的準確度和精密度

本試驗選擇了青菜、蘋果、生菜、草莓、芹菜和梨等6種不同種類的蔬菜水果陰性樣品，進行3個不同水平（1.0，5.0，20.0μg/kg）的添加回收試驗，測定后得到亞胺唑在不同基質(zhì)的回收率和相對標準偏差（RSD）見表4。由表4可知：符合農(nóng)藥殘留分析檢測的要求［11］。

表3 亞胺唑標準曲線Table 3 The standard curve of Imibenconazole

表4 亞胺唑加標回收率及精密度測定結果Table 4 The recovery rate of Imibenconazole in samples

3 結束語

本試驗建立了蔬菜與水果中亞胺唑殘留量的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC—MS—MS）檢測方法。與文獻［2］和［4］中采用的氣相及液相方法相比較，本試驗在定性上更加準確，檢出限能達到1.0μg/kg，靈敏度有了很大的提高。采用Florisil固相萃取柱凈化，消除了樣品中的蛋白、脂類等干擾物質(zhì)。但Florisil固相萃取柱吸附色素的能力有限，檢測色素含量較高的樣品時不能完全吸附色素，對試驗會產(chǎn)生干擾。通過使用GPC進行凈化可能會得到更好的凈化效果。

1 畢強，余鯨年.Imibenconazole——一種新的殺菌劑［J］.農(nóng)藥譯叢，1996，18（4）：63～64.

2 李薇，趙文芳，冷欣夫.梨果及土壤中亞胺唑及其代謝物的氣相色譜分析［J］.色譜，1998，16（6）：508～509.

3 熊芳，戴華，黃志強.氣相色譜法測定葡萄中烯唑醇農(nóng)藥的殘留量［J］.色譜，2002，20（4）：383～384.

4 周芳梅，蔡雙福，文燦，等.亞胺唑在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的檢測方法及持久性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（1）：234～237.

5 黃士忠，王繼軍，黃永春，等.酰胺唑及其代謝物在柑橘和土壤中的殘留動態(tài)研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2004，23（1）：181～185.

6 Akiko Kaihara，Kimihiko Yoshii，Yukari Tsumura，et al.Multiresidue analysis of pesticides in fresh fruits and vegetables by supercritical fluid Extraction and HPLC［J］.Journal of Health Science，2000，46（5）：336～342.

7 熊芳，戴華，李擁軍，等.高效液相色譜法測定葡萄中烯唑醇農(nóng)藥殘留量［J］.農(nóng)藥，2002，43（8）：22～23.

8 全國農(nóng)藥殘留實驗研究協(xié)作組編.農(nóng)藥殘留量實用檢測方法手冊 （第二卷）［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2001：428～437

9 王巖松，張春暉，張春野，等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定 蔬菜和水果中氟嗎啉的殘留量［J］.分析化學研究報告，2012，40（2）：286～291.

10 劉長令.世界農(nóng)藥大全 殺菌劑卷［M］.北京：化學工業(yè)出版，2006：80～82.

11 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，山西省農(nóng)藥重點實驗室.NY/T 788—2004農(nóng)藥殘留試驗準則［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.