凹土對乳酸球菌的吸附條件優(yōu)化

趙玉萍 唐梓鑫 楊 莉 馮云琪

（淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安 223001）

凹凸棒石黏土是一種具有一維納米棒晶結構的天然非金屬富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，簡稱凹土。凹土顯微結構包括3個層次：凹土的基本結構單元是微棒狀或纖維狀的一維納米結構，是針狀晶體；由棒晶結構緊密平行聚集而形成了棒晶束；棒晶束間或棒晶間相互聚集堆積成了各種層鏈狀的聚集體［1－3］。由于凹土晶體顆粒細小，因此外表面積很大，而其特有的晶體結構和堆積方式又形成了大量的孔道結構，因此內表面積也很大，使得凹土具有很強的吸附能力［1，2］。另外，凹土還具有很好的生物親和性［3］以及減少益生菌受胃腸道逆環(huán)境的損傷［4，5］。目前鮮有關于凹土對益生菌吸附性能和保護機理的報道。本研究擬優(yōu)化凹土對乳酸球菌的吸附條件，并對相關吸附性能進行研究，旨在為凹土作為益生菌保護劑的機理研究作一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸球菌：本實驗室保藏；

紫外光柵分光光度計：752型，上海精密科學儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：TGC-16G-A型，上海安亭科學儀器廠；

恒溫雙向磁力攪拌器：90-3型，上海振榮科學儀器有限公司；

MRS培養(yǎng)基［6］：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氫二銨2g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，吐溫-80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，H2O 1L，pH 6.2～6.4，121℃滅菌15min；

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：生化試劑，日本Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 凹土的純化 將未經處理的凹土研磨，過200目篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復3次［4］。

1.2.2 菌懸液的配置 取10mL對數(shù)生長期中后期菌液，此時，菌懸液在600nm處測定吸光度OD值為1.3左右，菌落為1.68×1010CFU，于5 000r/min離心10min，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌深沉兩遍，最后將菌體懸浮于生理鹽水中，配制成所需濃度。

1.2.3 離心條件的確定 將OD值相近的菌懸液和凹土懸液分別置于不同離心管，并分別加入80%的蔗糖溶液，離心，測上清液OD值。當凹土懸液上清液OD值接近于0而菌懸液上清液OD值與原來接近時，該離心條件作為測定吸附的條件［7］。

1.2.4 凹土活化最佳酸堿的確定 以濃度分別為0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mol/L 的 H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH 和濃度分別為3.0，5.0，8.0，10.0，15.0mol/L的NaOH和KOH活化處理凹土，液固比為10∶1（V∶m），活化30min，再用生理鹽水離心洗滌2次，待用［8，9］。

將活化好的凹土和菌懸液離心后的菌泥一起懸浮在10 mL的生理鹽水中，振蕩器充分混合均勻后轉移到50mL三角瓶中，放置于37℃，150r/min的搖床上振蕩2h。振蕩結束后，取振蕩后的混合液至離心管中，在最佳離心條件下離心，取上清液，測其OD值，確定凹土預處理的最佳酸或堿。

1.2.5 緩沖液最佳摩爾濃度的確定 將活化好的凹土和菌懸液離心后的菌泥一起懸浮在摩爾濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mol/L的 NaH2PO4—Na2HPO4緩沖液中，按1.2.4確定最佳摩爾濃度。

1.2.6 緩沖溶液最佳pH和最佳吸附時間的確定 將活化好的凹土和菌泥一起懸浮在pH分別為6.0，7.0，8.0的無菌NaH2PO4—Na2HPO4緩沖液中，于37℃，150r/min的搖床上分別振蕩20，40，60，80，100，120min，按1.2.4方法確定最佳pH。

1.2.7 吸附等溫線的繪制 在上述最佳吸附條件下，將凹土懸浮于最佳緩沖體系中，濃度為4g/L，分別吸附濃度為4.4，4.8，5.2，5.6，6.0，6.4，6.8，7.2g/L的乳酸球菌，充分吸附，考察溫度、菌體濃度對吸附的影響，繪制吸附等溫線［10］。

2 結果與討論

2.1 最佳離心條件的確定

凹土懸液和菌懸液OD值為1.269，在不同轉速下離心不同時間后，測上清液OD值，所得結果見表1。

表1 不同離心條件下懸液的OD值Table 1 Determination of centrifugal conditions

由表1可知，當在800r/min離心2min時，菌的OD值接近起始值，說明菌基本沒有沉降，而凹土OD值接近0，說明該條件下凹土基本沉降，故最佳離心轉速為800r/min，離心時間為2min。

2.2 預處理凹土最佳酸或堿的確定

用不同濃度的酸和堿處理純化凹土，再用預處理過的凹土吸附乳酸球菌，在800r/min離心2min，測上清液吸光度值，結果見圖1、2。

圖1 不同酸預處理凹土懸液吸光度值Figure 1 Results of different acids pretreating attapulgite

綜合圖1、2可知，用堿預處理凹土對乳酸球菌的吸附效果普遍不如酸。鹽酸和硫酸預處理效果又不如磷酸和乙酸。由圖1還可知，用濃度為1mol/L的磷酸處理凹土對乳酸球菌的吸附效果最佳，吸光度值最小。酸或堿預處理凹土，可除去分布于凹土微觀孔道結構中的雜質，疏通孔道，從而有利于吸附過程中吸附質分子在孔道結構中的擴散。用酸處理的效果較好，還可能是因為H＋置換了凹土層結構中的陽離子，如Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等，使孔容積得到了進一步增大，并且使原來層間的鍵力得到了削弱，使得層狀晶格得到了一定程度的開裂，孔道得到進一步的疏通，比表面積得到了進一步的增加，提高了吸附能力［11］。

圖2 不同堿預處理凹土懸液吸光度值Figure 2 Results of different alkalis pretreating attapulgite

2.3 緩沖液最佳摩爾濃度的確定

為探究磷酸緩沖液的摩爾濃度對凹土吸附乳酸球菌性能的影響，選擇pH 6，研究緩沖液不同摩爾濃度對吸附效果的影響，測定上清液吸光度值，結果見圖3。

圖3 緩沖液的摩爾濃度對吸附效果的影響Figure 3 Effects of different concentrations of buffer on the adsorption

由圖3可知，隨著緩沖液摩爾濃度的增加，吸光度值先減少后增加，即凹土對乳酸球菌的吸附先增大，后減小，當緩沖液摩爾濃度為0.4mol/L時，吸附率達到最大，因此凹土吸附乳酸球菌時緩沖液的最佳摩爾濃度為0.4mol/L。

2.4 緩沖液最佳pH和最佳吸附時間的確定

選擇摩爾濃度為0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，研究不同的pH對凹土吸附乳酸球菌的影響，結果見圖4。

由圖4可知，pH＝6和7時，吸附在60min時基本達到飽和，而pH＝8時，吸附在40min就達到飽和，但飽和吸附效果沒有微酸性和中性好，因此選擇pH 6作為最佳吸附pH。同時可以看出，凹土對乳酸球菌的吸附，隨著吸附時間的增加，吸附量先逐漸增大，然后趨于穩(wěn)定，之后吸附量保持不變。前60min，凹土對乳酸球菌的吸附很快，之后吸附速度明顯變慢，60min基本達到吸附平衡，因此凹土對乳酸球菌的最佳吸附時間為60min。

2.5 吸附等溫線結果

選擇幾組不同濃度的乳酸球菌菌液進行等溫吸附試驗，以平衡質量濃度pe對平衡吸附量qe作圖，得到凹土吸附乳酸球菌的吸附等溫線，見圖5。

圖4 不同pH和時間的緩沖液對吸附效果的影響Figure 4 Effects of different pH of buffer and time on the adsorption

圖5 吸附等溫線Figure 5 Adsorption isotherm curve

由圖5可知，隨著溫度的升高，凹土對乳酸球菌的吸附量增大，而且隨著平衡濃度的增大，平衡吸附量先增大，然后趨于平緩。

按照公式和表中數(shù)據(jù)進行Langmuir和Freundlich方程線性擬合，結果見表2、3。

對比表2和表3可知，表2中理論推導的單層飽和吸附量qm與試驗所得飽和吸附量q比較接近，且R12均普遍大于R22，因而在試驗研究的溫度和濃度范圍內，凹土對乳酸球菌的吸附能夠較好地符合Langmuir吸附等溫方程。隨著溫度升高，單層飽和吸附量qm增大，表明此吸附是吸熱過程，即升溫有利于凹土對乳酸球菌的吸附。由于b＞0，且有0＜RL＝1/（1＋bp0）＜1，即凹土對乳酸球菌的吸附為優(yōu)惠吸附。

表2 Langmuir線性擬合結果Table 2 The fitting results of Langmuir

表3 Freundlich線性擬合結果Table 3 The fitting results of Freundlich

3 結論

本研究對凹土進行純化，研究了純化凹土對乳酸球菌的最佳吸附條件。主要考察了吸附時間、緩沖液pH值、摩爾濃度以及溫度等因素對凹土吸附乳酸球菌的影響。通過用H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH、KOH 和 NaOH 預處理凹土可知，采用1mol/L的H3PO4預處理凹土，對乳酸球菌的吸附效果最好。在pH 6、0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液體系中，凹土對乳酸球菌的吸附在60min內基本完成，達到吸附平衡，是最佳的吸附條件。在試驗的pH范圍內，凹土對乳酸球菌的吸附速率隨pH的升高而變慢，說明吸附適宜在偏酸性的條件下進行。凹土對乳酸球菌的吸附能夠較好地符合Langmuir吸附等溫方程。隨著溫度的升高，凹土對乳酸球菌的平衡吸附量增大，表明此吸附是吸熱過程。當乳酸球菌的濃度增大時，平衡吸附量也在增大。凹土對乳酸球菌的吸附過程屬于優(yōu)惠吸附。

1 楊利營，盛京.凹凸棒粘土的研究開發(fā)應用［J］.江蘇化工，2001，29（6）：33～37.

2 樊國棟，沈茂.凹凸棒粘土的研究及應用進展［J］.化工進展，2009，28（1）：99～105.

3 Xi-Jun Ma，Li-Hua Liu，Kai Zhu.Preparation and properties of modified attapulgite/polyurethane bioactive macromolecular carrier ［J］.Research on Chemical Intermediates，2012（38）：223～232.

4 趙玉萍，黃穎娟，吳潔，等.以凹土為載體的新型益生菌制劑的制備［J］.食品工業(yè)科技，2013（3）：141～144.

5 趙玉萍.以凹土為載體的益生菌制備方法：中國，201010248836［P］.2010—12—22.

6 郭本恒.益生菌［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2004：22.

7 Xingmin Rong，Qiaoyun Huang，Xiaomin He，et al.Interation ofPseudomonasputidawith kaolinite and montmorillonite：a combination study by equilibrium adsorption，ITC，SEM and FTIR ［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2008（64）：49～55.

8 黃昭先.凹凸棒土吸附四環(huán)素的研究［D］.無錫：江南大學，2012.

9 傅正強.靖遠凹凸棒石吸附水溶液中Cd（II）性能的研究［D］.蘭州：蘭州大學，2013.

10 趙玉萍，馮良東，李輝.白腐菌預處理稻殼灰吸附性能研究［J］.中國糧油學報，2010，25（10）：104～107.

11 許干，杜衛(wèi)剛，周偉，等.改性凹凸棒土凈化含鉻廢水的研究［J］.天津化工，2007，21（6）：58～60.