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    清香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析

    2015-12-20 06:59:02葉光斌王彩虹羅惠波
    食品與機(jī)械 2015年3期
    關(guān)鍵詞:心曲大曲桿菌屬

    葉光斌 王彩虹 王 毅 甄 攀 王 勇 羅惠波

    (1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川 自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 自貢 643000;3.五糧液集團(tuán)質(zhì)量檢測(cè)中心,四川 宜賓 644000;4.山西杏花村汾酒廠股份有限公司,山西 汾陽 032200)

    清香型大曲是中國大曲清香型白酒的生產(chǎn)用曲,主要包括清茬曲、紅心曲和后火曲3種大曲。這3種大曲在生產(chǎn)上使用的原材料相同,生產(chǎn)流程也基本相似,可簡(jiǎn)單概括為:臥曲→上霉期→晾霉期→潮火期→干火期→后火期→養(yǎng)曲→出房驗(yàn)收→貯曲。所不同的是在培曲過程中,各曲種對(duì)培曲溫度的要求各不相同(見表1)。不同的制曲溫度及生產(chǎn)工藝,使得不同大曲內(nèi)的微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵特征各具特色,其產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物對(duì)白酒風(fēng)味形成也有所差異[1]。清香型白酒生產(chǎn)中將清茬曲、紅心曲和后火曲按照4∶3∶3的比例混合后使用[2]。采用不同工藝生產(chǎn)的3種大曲共同發(fā)酵,相輔相成,便形成了清香型白酒(大曲清香)獨(dú)特的風(fēng)格。因此,認(rèn)識(shí)清香型大曲內(nèi)不同曲種間微生物群落結(jié)構(gòu)與差異,對(duì)于研究清香型白酒發(fā)酵具有十分重要的意義。

    原核細(xì)胞核糖體小亞基16SrRNA基因,長(zhǎng)約1.5kb左右,大小適中,既含有高度保守的基因片段又具有種間變異的核酸片段,非常適合于進(jìn)行序列測(cè)定和菌屬間的分析比較,是理想的基因鑒定靶序列[3]。張守印等[4]對(duì)16SrDNA克隆文庫用于細(xì)菌群落分析的可靠性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,16SrRNA基因序列分析可以反映菌群中各種細(xì)菌的豐度,是一種較好的分析細(xì)菌菌群的方法。目前,16SrRNA基因克隆文庫技術(shù)也已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品[5,6]、城市污水[7]、土壤[8]等各類復(fù)雜環(huán)境中細(xì)菌微生態(tài)的研究。

    本研究擬以汾酒清香型大曲—清茬曲、后火曲、紅心曲為研究對(duì)象,通過提取大曲微生物總DNA、PCR擴(kuò)增及構(gòu)建細(xì)菌16SrRNA基因文庫,對(duì)其細(xì)菌群落組成進(jìn)行了比較研究,確定了3種大曲的優(yōu)勢(shì)菌群,為進(jìn)一步解析清香型大曲功能微生物、篩選優(yōu)良釀造微生物奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    大曲樣品:采集自山西杏花村汾酒集團(tuán)有限責(zé)任公司,全部為成品曲(見表1)。每個(gè)大曲樣品取3個(gè)平行,按“四分法”[9]將不同類型大曲分別粉碎混合,用無菌封口袋分裝后,置于-80℃保藏備用。

    引物:由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成;

    Taq酶、pMD19-T載體和EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶MspI和HhaI:大連寶生物有限公司;

    PCR儀:BIO-RAD Thermal Cycle型,美國 BIO-RAD公司;

    離心機(jī):Eppendorf Centrifuge 5418型,美國Eppendorf公司。

    表1 試驗(yàn)所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

    表1 試驗(yàn)所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

    來源山西杏花村。

    名稱 類型(制曲最高品溫) 所產(chǎn)白酒香型汾酒清茬曲 中溫曲(45~46℃)清香型清香型汾酒后火曲 中溫曲(46~48℃) 清香型汾酒紅心曲 中溫曲(最高可達(dá)50℃)

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 總DNA的提取及PCR擴(kuò)增 DNA提取參照文獻(xiàn)[10]。引物 Eub27f(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和 Eub1492r(5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3’)用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA[11,12],為了防止 PCR 偏差,每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。具體的PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序同葉光斌等的方法[10,12]。

    1.2.2 細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫的構(gòu)建 將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃過夜連接,通過熱激法(42℃熱激90s)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α(感受態(tài)細(xì)胞的效價(jià)約108個(gè)/μg)中。

    1.2.3 陽性克隆子的篩選及RFLP分析 菌落PCR篩選陽性克隆 子。引 物 RV-M(5'-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3')和 M13-47(5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3')用于菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序同葉光斌等的方法[10,12],利用MspI和HhaI雙酶切陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物的酶切圖譜,確定不同譜型,統(tǒng)計(jì)每一譜型出現(xiàn)的頻率及數(shù)目,并將不同譜型的克隆子送到上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 將16SrDNA序列相似性≥97%的序列定義為同一OTU(operational taxonomic units,運(yùn)算分類單位)[10,12]。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和RFLP統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,統(tǒng)計(jì)各文庫內(nèi)OTU數(shù)目及每個(gè)OTU在個(gè)克隆文庫的分布比例。將每個(gè)OTU的代表克隆子序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),找出與克隆子序列同源性最高的序列,用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和確定其分類地位。Seaview4軟件對(duì)齊序列,Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。文庫的評(píng)估方法參考葉光斌等的方法[10,12]。共有32個(gè)克隆子的16SrRNA基因序列上傳至NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫,GenBank序列號(hào)為KF984353-KF984384。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增

    不同大曲細(xì)菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜見圖1。由圖1可知,3種大曲樣品的細(xì)菌16SrDNA PCR擴(kuò)增效果都很好,均得到了一條較亮的1 500bp左右的目的條帶。

    圖1 細(xì)菌16SrRNA基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Figure 1 The electrophoresis diagram of PCR products of bacterial 16SrRNA gene

    2.2 陽性克隆子檢測(cè)及RFLP分析

    部分菌落PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖2。菌落PCR產(chǎn)物為單條帶,且片段長(zhǎng)度在1 600bp左右的均可視為陽性克隆子。清茬曲、后火曲和紅心曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)分別有45,60和45個(gè)陽性克隆子用于后續(xù)的RFLP分析。將各文庫的陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物通過MspI和HhaI雙酶切后,進(jìn)行RFLP分析,部分RFLP電泳圖譜見圖3。不同大曲樣品根據(jù)RFLP分析結(jié)果,挑選不同譜型的32個(gè)代表克隆子進(jìn)行測(cè)序,并與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)(見表3)。

    圖2 部分克隆子菌落PCR產(chǎn)物電泳圖譜Figure 2 The electrophoretogram of colony PCR products of partial colonies

    圖3 部分陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜(MspI和HhaI雙酶切)Figure 3 The electrophoretogram of double enzyme digested products from PCR products of partial positive colonies(Digested with MspI and HhaI)

    2.3 細(xì)菌16SrRNA基因文庫的評(píng)估

    3種大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。從文庫覆蓋率上看,在64%~72%,均未達(dá)到飽和;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示3種清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落多樣性豐富;且從物種多樣性上看,后火曲>清茬曲>紅心曲。Buzas-Gibson均一度指數(shù)的分析結(jié)果表明,紅心曲>后火曲>清茬曲。盡管以上3個(gè)文庫均未達(dá)到飽和,但該文庫能在一定程度上反映各樣品內(nèi)的主要細(xì)菌類群的多樣性及豐度差異。

    2.4 清香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

    清茬曲、后火曲、紅心曲的細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子在文庫中的分布及NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)信息見表3。由表3可知:克隆子與對(duì)應(yīng)序列間的相似度均達(dá)到98%以上。代表克隆子參與構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知,所有清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落主要分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱。芽孢桿菌綱內(nèi)克隆子主要分布于乳桿菌目(Lactobacillales)和芽孢桿菌目(Bacillales)。其中乳桿菌目?jī)?nèi)克隆子種類最多,共有11個(gè)OTUs,主要分布于乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、明串株菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus);芽孢桿菌目?jī)?nèi)克隆子包含有5個(gè)OTUs,分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)。放線菌綱內(nèi)克隆子主要分布于放線菌目(Actinomycetales)內(nèi)的鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、考克氏菌屬(Kocuria)及Brachybacterium屬。變形桿菌綱內(nèi)克隆子主要分布于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和泛菌屬(Pantoea)。

    表2 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

    表2 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

    通常Shannon-Wiener指數(shù)數(shù)值越大,表明文庫中克隆子多樣性越豐富;Simpson指數(shù)越接近1,表明文庫中克隆子多樣性越豐富;Buza-Gibson均一度指數(shù)越接近1,表明文庫中克隆子分布越均勻[10,12,13]。

    文庫來源 克隆子數(shù)目 OUT數(shù)目 文庫覆蓋率/%Buzas-Gibson均一度指數(shù)清茬曲Shannon-Wiener指數(shù)Simpson指數(shù)45 13 71.11 2.39 0.89 0.84 45 16 64.44 2.51 0.90 0.78后火曲 60 19 68.33 2.71 0.92 0.79紅心曲

    從克隆子分布表和系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出:乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串株菌屬在3個(gè)大曲中同時(shí)存在;高溫放線菌屬只存在于制曲品溫較高的后火曲和紅心曲中;乳球菌屬和短桿菌屬只存在于清茬曲和后火曲中;泛菌屬只存在于清茬曲和紅心曲中;考克氏菌屬和短桿菌屬是清茬曲的特有菌群;鏈霉菌屬和不動(dòng)桿菌屬是后火曲的特有菌群。其中,清茬曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬(占全部克隆子的比例為37.78%,7OTUs)和葡萄球菌屬(22.22%,1OTU);后火曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬(占全部克隆子的 比 例 為 35%,8OTUs)、葡 萄 球 菌 屬 (16.67%,2 OTUs)、芽孢桿菌屬(16.67%,2OTUs)、魏斯氏菌屬(13.33%,1OTU);紅心曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬(占全部克隆子的比例 為 26 .67%,6OTUs)、芽 孢 桿 菌 屬 (28.89%,2 OTUs)、高溫放線菌屬(17.78%,1OTU)??傮w而言,清香型3種曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異,后火曲分別與清茬曲和紅心曲比較相似,而清茬曲和紅心曲間群落相似性較低。

    據(jù)周恒剛[14]、胡承等[15]報(bào)道,制曲品溫在30℃左右較適合微生物的生長(zhǎng),而隨著溫度的上升微生物的活菌數(shù)也呈倍下降,大多數(shù)不耐高溫的細(xì)菌逐漸死亡。汾酒3種大曲微生物群落的差異與大曲生產(chǎn)過程中溫度的控制密切相關(guān)。

    紅心曲制曲溫度最高,因此耐高溫的芽孢桿菌和高溫放線菌與不耐高溫的細(xì)菌相比具有較大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),在文庫中占了較高的比例,但細(xì)菌群落多樣性較其它兩種曲低;后火曲的制曲溫度較清茬曲的高,因此后火曲中芽孢桿菌所占的比例明顯高于清茬曲,后火曲中也有較低含量的高溫放線菌分布;而清茬曲制曲溫度最低,未檢測(cè)到高溫放線菌的存在。不同的制曲溫度使得微生物的生長(zhǎng)和發(fā)酵特征也各具特色,其產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物對(duì)白酒風(fēng)味形成也有所差異,汾酒采用不同工藝生產(chǎn)的3種大曲共同發(fā)酵,三者相輔相成,便形成了汾酒獨(dú)特的風(fēng)格。

    表3 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子的分布及比對(duì)信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

    表3 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子的分布及比對(duì)信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

    “QCQX”、“HHQX”、“HXQX”分別代表清茬曲、后火曲、紅心曲細(xì)菌16SrDNA文庫克隆子。

    代表克隆子編號(hào)清茬曲分布比例/%后火曲分布比例/%紅心曲分布比例/% 近似序列號(hào) 相似率/%分類信息QCQX-12 11.11 5.00 4.44 AB605665 99 Lactobacillus paralimentarius QCQX-88 8.90 6.67 6.67 HQ322272 99 Lactobacillus sp.HHQX-18 4.44 3.33 4.44 AB598972 99 Lactobacillus sp.QCQX-4 4.44 5.00 4.44 NR_036788 99 Lactobacillus pontis QCQX-74 4.44 1.67 4.44 NR_075038 99 Lactobacillus sanfranciscensis HHQX-81 2.22 3.33 0.00 EF120367 99 Lactobacillus brevis HHQX-9 2.22 3.33 2.22 EF536361 99 Lactobacillushelveticus HHQX-2 0.00 6.67 0.00 DQ399353 99 Lactobacillusparacasei QCQX-7 8.90 6.67 8.90 NR_074694 99 Leuconostoc citreum HHQX-20 8.90 13.33 4.44 DQ321751 99 Weissella sp.QCQX-58 4.44 1.67 0.00 AB601163 99 Lactococcus lactis subsp.lactis HXQX-70 0.00 5.00 17.78 AJ251778 99 Thermoactinomyces sanguinis QCQX-33 22.22 13.33 0.00 NR_024667 99 Staphylococcus sp.HHQX-16 0.00 3.33 4.44 EU855191 99 Staphylococcus sciuri HHQX-8 0.00 13.33 15.56 JQ291596 99 Bacillus licheniformis HXQX-92 2.22 3.33 13.33 JX680141 99 Bacillus sp.HHQX-14 0.00 1.67 0.00 NR_041208 98 Streptomyces albus QCQX-27 6.67 1.67 0.00 AY243345 99 Brevibacterium linens QCQX-6 2.22 0.00 0.00 NR_025502 99 Brachybacterium paraconglomeratum QCQX-65 4.44 0.00 0.00 FJ607312 99 Kocuria koreensis HHQX-32 0.00 1.67 0.00 NR_074737 99 Acinetobacter baumannii HXQX-16 2.22 0.00 8.90 FJ756354 99 Pantoea sp.

    潘勤春等[16]通過PCR—DGGE技術(shù)對(duì)汾酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果表明制曲品溫最低的清茬曲多樣性最豐富,制曲品溫最高的紅心曲群落組成最簡(jiǎn)單,后火曲居中,且清茬曲和紅心曲間群落組成差異較大,測(cè)序結(jié)果表明,清香型大曲內(nèi)細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬、不動(dòng)桿菌屬、土壤球菌屬,且芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)類群。高亦豹[17]運(yùn)用PCR—DGGE技術(shù)對(duì)不同工藝大曲(包括汾酒清茬曲、后火曲、紅心曲)的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明清香型大曲中乳酸菌多樣性較豐富,包括Lactobacillu.helveticus、L.panis、L.pontis、L.fermentum、Weissellacibaria;地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為大曲中的優(yōu)勢(shì)菌;而Thermoactinomycessanguinis僅存在于醬香型大曲中。Zhang等[18]通過454測(cè)序技術(shù)研究汾酒3種清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落組成,結(jié)果表明3種大曲內(nèi)細(xì)菌種群主要分布于厚壁菌門和放線菌門,厚壁菌門是優(yōu)勢(shì)種群,分別占清茬曲、后火曲和紅心曲的72.2%,98.6%,81.4%;乳酸菌種類豐富,主要包括Weissellacibaria、Leuconostoccitreum、Lactobacillussakei、L.pontis、L.paralimentarius和L.mindensis;清茬曲內(nèi)優(yōu)勢(shì)科為鏈霉菌科和明串珠菌科;后火曲內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌;紅心曲內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌為高溫放線菌科和鏈霉菌科。但未見γ-變形桿菌的報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)汾酒大曲的研究中也發(fā)現(xiàn)乳酸菌的多樣性非常豐富,芽孢桿菌是紅心曲和后火曲的優(yōu)勢(shì)菌群,這一結(jié)論與潘勤春[16]、高亦豹[17]、Zhang[18]等的結(jié)論較一致;不同的是在具體的屬種組成比例上存在差異,且本研究得到的細(xì)菌多樣性更豐富。此外本研究在清香型大曲的后火曲和紅心曲內(nèi)均檢測(cè)到了較高比例的高溫放線菌(Thermoactinomycessanguinis)。導(dǎo)致以上差異的原因可能是由于試驗(yàn)方法或試驗(yàn)樣品的不同導(dǎo)致的。

    圖4 清香型大曲細(xì)菌克隆子16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of bacterial 16SrRNA gene of Fen-Daqus

    3 結(jié)論

    通過細(xì)菌16SrRNA基因文庫法和RFLP指紋技術(shù)系統(tǒng)研究了清香型大曲清茬曲、后火曲和紅心曲內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。研究結(jié)果表明:制曲溫度對(duì)于清香型3種大曲內(nèi)細(xì)菌多樣性具有顯著影響,制曲溫度較低的清茬曲和后火曲的細(xì)菌多樣性要明顯高于制曲溫度較高的紅心曲。3種大曲的細(xì)菌多樣性豐富,均分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱,但在具體種屬組成上存在明顯差異;其中清茬曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群為乳桿菌屬和葡萄球菌屬;后火曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬;紅心曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬。

    此外,本試驗(yàn)在進(jìn)行測(cè)序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)過程中發(fā)現(xiàn),部分克隆子的測(cè)序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中多個(gè)同屬不同種菌株的序列相似度都達(dá)到98%以上,如代表克隆子HHQX-20,與魏斯氏菌屬的Weissellaconfusa、W.cibaria的相似度均為99%;HXQX-92與芽孢桿菌屬的Bacillus aerophilus、B.stratosphericus、B.pumilus相似度均達(dá)到98%以上;QCQX-88與乳桿菌屬的L.farciminis、L.futsaii、L.crustorum的相似度均達(dá)到98%以上。而在群落多樣性分析時(shí),由于只將序列相似度≥97%計(jì)為同一種OTU類型,因此可能會(huì)低估了清香型大曲的細(xì)菌多樣性。后期的研究將結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù),以進(jìn)一步確定以上大曲內(nèi)的細(xì)菌群落組成信息,并有目的的針對(duì)清香型大曲的主要細(xì)菌類群進(jìn)行分離、純化和發(fā)酵機(jī)理的相關(guān)研究,以弄清其在清香型白酒固態(tài)發(fā)酵中的具體作用。

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