酸性電解水處理后南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性變化

付嬌嬌，彭織云，劉海泉，孫曉紅，潘迎捷，趙　勇，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海201306）

酸性電解水處理后南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性變化

付嬌嬌1，2，3，彭織云1，2，3，劉海泉1，2，3，孫曉紅1，2，3，潘迎捷1，2，3，趙勇1，2，3，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海201306）

腸道微生物是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要污染源之一。酸性電解水（AEW）作為新型環(huán)保消毒劑，因其高效廣譜殺菌的特點，已逐漸被應(yīng)用于水產(chǎn)品安全控制方面并且日益受到人們的重視。本研究采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)，分析了經(jīng)自來水（TW）與酸性電解水分別處理的南美白對蝦（Penaeus vannawei）于0、4、25℃貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)酸性電解水處理后的樣品腸道微生物多樣性在貯藏過程中有所減少。因此，酸性電解水能明顯改變腸道微生物的多樣性，為其保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了理論參考依據(jù)。

南美白對蝦，酸性電解水，腸道微生物，變性梯度凝膠電泳（DGGE）

南美白對蝦因其營養(yǎng)價值高、肉質(zhì)鮮美而廣受消費者喜愛，但其在運輸、生產(chǎn)加工、貯藏過程中易腐敗變質(zhì)[1]。近年來，藍蔚青等[2]探討了鯧魚冷藏過程中不同種類細菌的變化規(guī)律。陳慧斌等[3]研究了4℃冷藏期間牡蠣鰓部菌群的動態(tài)變化，但很少有人關(guān)注水產(chǎn)品貯藏過程中腸道細菌的種群變化。腸道微生物是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要因素之一，因此，研究水產(chǎn)品腸道細菌結(jié)構(gòu)在貯藏過程中的變化規(guī)律尤為重要。通過選擇不同的保鮮劑和包裝方式，可以改善水產(chǎn)品的貯藏品質(zhì)，延長貨架期[4]。已有研究表明乳酸菌生物保護劑可以有效抑制冷凍水產(chǎn)品中單增李斯特菌的生長[5]。徐曉瑾等[6]研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝是一種有效地抑菌包裝方式，可延長生鮮冷卻牛肉的保鮮期。相比于其他化學(xué)殺菌劑，酸性電解水具有安全性好，快速、廣譜殺菌的特點[7-8]。因此，研究電解水在食品安全方面的應(yīng)用具有現(xiàn)實意義。藍蔚青等[9]研究表明酸性電解水能在短時間內(nèi)抑制細菌生長，使帶魚的冷藏貨架期延長2～3d。謝軍等[10]發(fā)現(xiàn)酸性電解水能有效減少蝦體細菌總數(shù)，但酸性電解水在延長水產(chǎn)品貨架期的同時是否改變了其腸道微生物的結(jié)構(gòu)尚未見報道。

PCR-DGGE技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物菌落多樣性和種群差異研究，目前已經(jīng)成為微生物分子生態(tài)學(xué)研究的主要方法之一[11-13]。本文基于PCR-DGGE技術(shù)，分析了經(jīng)自來水與酸性電解水處理后南美白對蝦腸道微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性的變化規(guī)律，為進一步控制南美白對蝦貯藏過程中的腐敗變質(zhì)及酸性電解水技術(shù)在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用提供了參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南美白對蝦購于上海市普陀區(qū)銅川路水產(chǎn)品市場。實驗選取相同規(guī)格的個體（平均約25g），將其分為A、B兩組，樣品分別編號a～r。A組用自來水，B組用50ppm的酸性電解水分別浸泡1min后放入均質(zhì)袋中，置于0、4、25℃條件下貯藏。分別采集貯藏0、1、3、4、6d蝦腸道0.1g于1.5mL離心管中，-80℃保存。

FW-200型強酸性電解水生成器日本Amano公司；高精度恒溫培養(yǎng)箱日本Sanyan公司；BagMixer 400 VW型拍打式均質(zhì)器法國Interscience公司；離心機、PCR擴增儀德國Eppendorf公司；DGGE電泳儀、Bio-Rad凝膠成像儀分析系統(tǒng)美國BioRad公司；PCR試劑盒中國上海LifeFeng公司；腸道DNA提取試劑盒德國Qiagen公司；酶標儀美國BioTek公司。

1.2實驗方法

1.2.1腸道微生物群落總DNA提取使用腸道DNA提取試劑盒提取腸道樣品的總DNA，提取步驟按說明書操作，提取后的DNA置于-20℃保存待用。

1.2.2PCR擴增選取細菌16S rDNA的V3可變區(qū)進行PCR擴增。引物序列如下：上游引物V3-2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和帶GC夾子的下游引物V3-3：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。25μL PCR反應(yīng)體系為：PCR mix 12.5μL、引物V3-2和V3-3各1μL、ddH2O 8.5μL，DNA模板2μL。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，20個循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker選用DL2000，紫外檢測擴增產(chǎn)物，凝膠成像。

1.2.3變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）將PCR產(chǎn)物用DGGE分離，凝膠的配制采用8%聚丙烯酰胺凝膠，其中變性劑濃度梯度為35%～60%（100%的變性膠包含7mol/L尿素和40%甲酰胺）。PCR擴增產(chǎn)物上樣量為8μL，上樣前調(diào)整PCR產(chǎn)物的濃度使?jié)舛纫恢?。采用D code DGGE（Bio-Rad）進行電泳，電泳緩沖液為1×TAE（Tris-磷酸），在60℃條件下120V電壓電泳4h左右。凝膠染色，電泳結(jié)束后，凝膠于EB染液中染色20min，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Quantity One 4.6.2軟件將DGGE圖譜數(shù)字化后得到每個樣品中可檢測條帶的細菌豐度，有條帶記為“1”，無條帶則記為“0”。將輸出的數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入NTSYS-pc 2.10e軟件，比較各個泳道之間的相似性，并進行UPGAMA聚類分析并采用Canoco for Windows 4.5軟件進行主成分分析。根據(jù)電泳圖譜中每個條帶的亮度，用香濃-威納多樣性指數(shù)（Shanno-Wiener index，H）分析各樣品多樣性。公式如下：

式中，H為香濃-威納多樣性指數(shù)，S為DGGE膠中條帶數(shù)量，Pi為i條帶所占百分比。

2　結(jié)果與分析

2.1DGGE圖譜分析及多樣性分析

18個樣品的DGGE電泳結(jié)果如圖1所示。不同位置的條帶代表不同種屬細菌，條帶的熒光強度則反映了該細菌的豐富度，條帶信號越亮，表示該種屬細菌的相對數(shù)量越多[14]。由圖1可知，每個樣品中強度高的條帶在泳道中的遷移率不同，說明各樣品中優(yōu)勢菌群有所不同，直觀地反映了南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性。比較圖1中0℃貯藏條件下自來水（TW）與酸性電解水（AEW）分別處理的樣品，其腸道細菌的結(jié)構(gòu)存在明顯的多樣性差異，此現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在4℃及25℃條件貯藏過程中。表明酸性電解水改變了腸道微生物的多樣性。

圖1　各樣品16S rDNA基因擴增產(chǎn)物的DGGE電泳結(jié)果Fig.1　DGGE electrophoresis of 16S rDNA gene amplification products from the samples

根據(jù)DGGE圖譜數(shù)字化結(jié)果可得，經(jīng)自來水處理于0、4、25℃條件下貯藏的三組樣品（a、c、e、g，i、k、m，o、q）分別在DGGE圖譜上產(chǎn)生11、9、12、13，11、10、13，10、11條可以鑒別的條帶；同樣，經(jīng)酸性電解水處理于0、4、25℃條件下貯藏的三組樣品（b、d、f、h，j、l、n，p、r）分別在DGGE圖譜上產(chǎn)生11、10、13、9，15、13、10，11、10條可以鑒別的條帶，條帶數(shù)量的多少反映了該樣品代表的腸道環(huán)境中細菌的多樣性程度。結(jié)果顯示，自來水處理的樣品在0、4、25℃條件下貯藏過程中，其腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性呈上升趨勢，而在酸性電解水處理樣品中有所下降，表明酸性電解水對蝦腸道細菌增殖有一定的抑制作用。觀察DGGE圖譜中S位置上的條帶，發(fā)現(xiàn)其在泳道上處于相似位置。該結(jié)果可推測貯藏過程中對蝦腸道內(nèi)存在某一穩(wěn)定增殖的細菌，但并不能認為這些條帶所代表的就一定是同樣的細菌。

多樣性指數(shù)（H′，Shannon-wiener index）是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標[15]。由表1可知，多樣性指數(shù)在整個監(jiān)測周期內(nèi)呈周期性波動變化，說明了對蝦腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)在時間上的演替變化。分析0℃及4℃貯藏條件下的兩組樣品，發(fā)現(xiàn)貯藏時間達到48h之后，腸道菌群的多樣性開始明顯增加，表明腸道細菌種類在貯藏前期發(fā)生了改變。此外，酸性電解水處理后的樣品在貯藏48h時腸道細菌的多樣性指數(shù)最低，表明其高效的抑菌作用。分析25℃條件下貯藏的樣品，實驗結(jié)果顯示當貯藏時間達到24h時，酸性電解水處理樣品的腸道細菌多樣性指數(shù)略低于自來水處理樣品，可進一步表明酸性電解水的抑菌作用。

表1　樣品細菌種群多樣性指數(shù)Table.1　Shannon-Wiener index

2.2DGGE圖譜的聚類分析及主成分分析

UPGAMA相似性聚類分析結(jié)果（表2）顯示，所有樣品相似性在0.44～1.0，說明各樣品腸道種群結(jié)構(gòu)有所差異。由圖2可知，不同貯藏溫度下，自來水與酸性電解水處理的第0d腸道樣品被聚為一類，顯示出它們具有較為相似的種群結(jié)構(gòu)，其平均相似系數(shù)為0.93。隨著貯藏時間的增加，樣品間的相似系數(shù)逐漸降低，如酸性電解水處理樣品于4℃貯藏第0d與第3d的相似系數(shù)僅為0.44，表明酸性電解水明顯改變了腸道微生物的多樣性及腸道微生物種類變化主要發(fā)生在貯藏前期。

圖2　DGGE圖譜的聚類分析Fig.2　Cluster analysis of DGGE fingerprinting profile

表2　樣品腸道微生物相似系數(shù)Table.2　Similarity coefficients of intestinal microorganisms of samples

DGGE圖譜的PCA分析結(jié)果如圖3所示。樣品之間的距離代表了它們的差異大小。主成分因子1（PC1）的貢獻率為32.9%，主成分因子2（PC2）的貢獻率為14.4%；PC1明顯地將樣品分成2個部分，自來水處理的樣品（1～9）集中分布在圖的左邊，酸性電解水處理的樣品（10～18）分散在圖的右邊。表明自來水處理與酸性電解水處理的樣品腸道細菌結(jié)構(gòu)多樣性存在明顯差異。此外，圖中酸性電解水處理的樣品分布比較發(fā)散，表明其明顯影響了腸道微生物的多樣性。圖中8、9是經(jīng)自來水處理于25℃條件下貯藏第0d與第1d的腸道樣品，該貯藏溫度下的樣品間距相差較大，此現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在酸性電解水處理組（17～18）。表明在25℃環(huán)境條件下，細菌適宜生長從而使腸道微生物多樣性發(fā)生了較大的改變。

圖3　DGGE圖譜的PCA分析Fig.3　PCA analysis of DGGE fingerprinting profile

3　結(jié)論與討論

DGGE方法有不需要培養(yǎng)、分辨率高、結(jié)果準確可靠、重復(fù)性好、檢測速度快、可同時檢測多種微生物等優(yōu)點[16]，在本研究中，16S rDNA V3區(qū)的PCRDGGE圖譜能夠很好地區(qū)分蝦腸道內(nèi)的細菌，雖然數(shù)據(jù)不能代表所有對蝦腸道內(nèi)細菌群落的情況，但可以說明PCR-DGGE技術(shù)能夠有效地用于腸道菌群的分析。

酸性電解水作為一種新型的環(huán)保殺菌劑，已逐步應(yīng)用于食品保鮮中。近年來，國內(nèi)外學(xué)者均有關(guān)于電解水殺菌效果的研究報道。李秀麗等[17]研究表明酸性電解水能有效減少熟制蝦仁中的細菌總數(shù)；李華貞等[18]研究表明酸性電解水可以抑制新鮮果蔬中的細菌增殖，延長其保鮮期。林婷、Abdulsudi等[19-20]研究結(jié)果同樣表明酸性電解水具有高效的抑菌作用，而這些研究都是基于酸性電解水對食品表面微生物的作用效果。由于腸道微生物也是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要污染源之一，所以本研究重點關(guān)注酸性電解水處理后的水產(chǎn)品在貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化。由實驗結(jié)果可知，酸性電解水處理的蝦樣腸道微生物多樣性在貯藏過程中有所減少并且與對照組存在明顯差異，不僅進一步證明了酸性電解水具有高效抑菌的作用，同時揭示了其能夠顯著影響水產(chǎn)品腸道微生物的多樣性，這可能與延長水產(chǎn)品貨架期有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)兩種不同方式處理的樣品，其腸道微生物優(yōu)勢種群在貯藏前期都發(fā)生了明顯的改變，因此在鮮蝦安全控制中應(yīng)在前期采取有效措施以改善食品品質(zhì)。此外，DGGE圖譜中S位置上的條帶細菌在樣品貯藏過程中穩(wěn)定存在，但不能認為就是同一種細菌，這些細菌可能是引起水產(chǎn)品貯藏過程中腐敗變質(zhì)的特定腐敗菌。因為本文重點關(guān)注的是酸性電解水處理的水產(chǎn)品在貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化，所以沒有對單一條帶進行深入的分析。

酸性電解水的研究主要集中在其高效的殺菌效果，而其在影響水產(chǎn)品品質(zhì)方面也有相關(guān)報道。已有研究表明電解水能夠減少冷藏河豚魚中揮發(fā)性鹽基氮、pH、硫代巴比妥酸值等品質(zhì)指標的變化，同時還可以減少河豚魚肉的硬度、彈性和回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)結(jié)果的變化，從而延長了冷藏河豚魚的貨架期[21]。謝軍等[22]研究表明電解水浸泡生蝦后基本上不影響其感官品質(zhì)，可以代替自來水用于原料蝦的清洗。結(jié)合本研究結(jié)果表明，酸性電解水具有高效、廣譜殺菌的作用且能夠顯著改變腸道微生物的多樣性，為其保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了參考依據(jù)以及為探討酸性電解水延長水產(chǎn)品貨架期的機理提供了理論支撐。

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Changes of acidic electrolyzed water on intestinal microflora diversity of Penaeus vannawei during storage

FU Jiao-jiao1，2，3，PENG Zhi-yun1，2，3，LIU Hai-quan1，2，3，SUN Xiao-hong1，2，3，PAN Ying-jie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3，*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；3.Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China）

Intestinal microflora was considered as one of the major sources to cause the corruption of aquatic products.As a new-type environmental disinfectant，acidic electrolyzed water（AEW）had gradually been applied to control the security of aquatic products，which was receiving more and more attentions due to its efficient broad-spectrum sterilization.In this paper，PCR-DGGE technology was used to analyze the variation of intestinal microflora diversity in Penaeus vannamei stored at 0℃，4℃and 25℃，which were treated by tapwater（TW）and AEW，respectively.Compared with TW group，samples under AEW showed a decreasing diversity of intestinal microflora during storage，which indicated that intestinal microflora diversity was significantly affected by AEW.The results would be used to provide a theoretical reference for the security of aquatic products.

Penaeus vannamei；AEW；intestinal microflora；DGGE

TS254.4

A

1002-0306（2015）04-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.066

2014－05－06

付嬌嬌（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品預(yù)測微生物學(xué)及定量風險評估。

趙勇（1975-），男，博士，教授，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)方面的研究。

國家自然科學(xué)基金（31271870）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會部分地方院校能力建設(shè)項目（11310501100）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技創(chuàng)新行動計劃項目（12391901300）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號）。