糯米糠抗氧化肽的制備工藝及自由基清除能力研究

李俐樺，殷鐘意，鄭旭煦，，*

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，重慶400067；2.重慶工商大學(xué)催化與功能有機(jī)分子重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400067）

糯米糠抗氧化肽的制備工藝及自由基清除能力研究

李俐樺1，殷鐘意2，鄭旭煦1，2，*

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，重慶400067；2.重慶工商大學(xué)催化與功能有機(jī)分子重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400067）

為開發(fā)利用糯米糠資源，研究了糯米糠抗氧化肽的制備工藝及自由基清除能力。選取中性蛋白酶為水解酶，以抗氧化肽還原力為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化糯米糠抗氧化肽的制備工藝。結(jié)果表明，制備糯米糠抗氧化肽的最佳工藝條件為糯米蛋白底物濃度4%、[E]/[S]2%、pH7、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間6h，在該條件下制備的糯米糠抗氧化肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力明顯優(yōu)于米糠抗氧化肽，且存在一定的量效關(guān)系，提示糯米糠抗氧化肽可用作功能性食品或天然抗氧化劑被深入研究和開發(fā)利用。

糯米糠，抗氧化肽，酶解，自由基清除能力

米糠是大米加工的下腳料，含有米皮層或米胚碎米等，油脂含量14%～24%，蛋白質(zhì)含量12%～18%；我國是世界上米糠資源最為豐富的國家，但米糠有效利用率較低，大多用作飼料，資源浪費(fèi)較為嚴(yán)重，因此聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織將其稱為一種未充分利用的原料[1]。近年來，隨著科技的不斷進(jìn)步，米糠資源正逐步被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，深加工產(chǎn)品主要有稻米油、蛋白、植酸、膳食纖維、高蛋白飼料粉與抗氧化肽等，它們?cè)谑称?、飼料、醫(yī)藥行業(yè)等均有廣泛應(yīng)用前景[2]。但是，國內(nèi)外關(guān)于糯米糠的研究極少，除早期可見糯米糠成分[3]和近期可見糯米抗氧化肽[4]的研究報(bào)道外，有關(guān)糯米糠深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用鮮見報(bào)道。

眾所周知，清除自由基并防止其氧化作用對(duì)人體細(xì)胞及組織造成破壞的研究非常重要。多項(xiàng)研究表明[1，5-7]，水解米糠蛋白而獲得的抗氧化肽不僅對(duì)自由基具有較強(qiáng)的清除作用，而且本身無任何毒副作用，其開發(fā)利用前景看好。近期本課題組研究發(fā)現(xiàn)，糯米糠的組成以及蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成不同于米糠，而糯米糠的抗氧化肽是否也有異于米糠抗氧化肽。為此，本文以糯米糠為原料，以米糠為對(duì)照，通過研究糯米糠抗氧化肽的制備工藝及自由基清除能力，旨在為糯米糠深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糯米糠、米糠重慶市長壽區(qū)鳳城鎮(zhèn)；脫脂糯米糠、米糠采用超臨界CO2萃取油脂后的糯米糠和米糠；中性蛋白酶9068-59-1（酶活力≥100U/mg） 上海金穗生物科技公司（BR）；氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、Tris等均為國產(chǎn)分析純。

二元智能水浴HH-S2鄭州長城科工貿(mào)有限公司；高速冷凍離心機(jī)Biofuge Stratos D-37520 Osterode；PB-10酸度計(jì)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；V-1200可見光分光光度計(jì)MAPADA；微量移液器上海昂精密科學(xué)儀器有限公司制造；CL-4A型平板加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DZF-1B型真空恒溫干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糯米糠抗氧化肽的制備工藝

1.2.1.1糯米糠蛋白的制備工藝首先將脫脂糯米糠粉碎，在烘箱中干燥15min，使其水分含量不高于8%；然后用pH10.0的NaOH溶液（1∶100）浸提3h，離心分離10min；最后用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液的pH至4.5，待沉淀完全后，在6000r/min離心10min，將沉淀干燥，得到糯米糠蛋白[8]。

1.2.1.2糯米糠抗氧化肽的制備工藝首先在100℃水浴鍋中放入已配好一定底物濃度的糯米糠蛋白，加熱20min，進(jìn)行蛋白質(zhì)變性處理；然后冷卻至室溫后，加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在不同條件下進(jìn)行酶水解；最后將水解液于90℃水浴鍋中加熱20min，再6000r/min離心10min，將清液真空干燥至水分含量不高于8%，得到糯米糠抗氧化肽，測(cè)定其性能指標(biāo)[6]。

綜上所述，制備工藝流程為：脫脂糯米糠→粉碎烘干→浸提→離心分離→酸水解→離心分離→沉淀干燥→糯米糠蛋白→糯米糠蛋白溶液→熱變性處理→酶水解→滅酶→離心分離→濃縮干燥→糯米糠活性肽→性能測(cè)定。

1.2.1.3糯米糠抗氧化肽制備的單因素實(shí)驗(yàn)

a.不同糯米蛋白底物濃度對(duì)還原力的影響以米糠抗氧化肽的還原力為指標(biāo)，在[E]/[S]為2%、pH為7、酶解溫度為40℃、酶解時(shí)間為5h的條件下，分別選取糯米蛋白底物濃度為2%、3%、4%、5%、6%，按照1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

b.不同加酶量[E]/[S]對(duì)還原力的影響以米糠抗氧化肽的還原力為指標(biāo)，在底物濃度為3%、pH為7、酶解溫度為40℃、酶解時(shí)間為5h的條件下，分別選取加酶量[E]/[S]為1%、2%、3%、4%、5%，按照1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

c.不同pH對(duì)還原力的影響以米糠抗氧化肽的還原力為指標(biāo)，在底物濃度為3%、[E]/[S]為2%、酶解溫度為40℃、酶解時(shí)間為5h的條件下，分別選取溶液pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0按照1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

d.不同酶解溫度對(duì)還原力的影響以米糠抗氧化肽的還原力為指標(biāo)，在底物濃度為3%、[E]/[S]為2%、pH為7、酶解時(shí)間為5h的條件下，分別選取酶解溫度為35、40、45、50、55℃按照1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

e.不同酶解時(shí)間對(duì)還原力的影響以米糠抗氧化肽的還原力為指標(biāo)，在底物濃度為3%、[E]/[S]為2%、pH為7、酶解溫度為40℃的條件下，分別選取時(shí)間為2、3、4、5、6h，按照1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.4糯米糠抗氧化肽制備的正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交表（見表1）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定米糠抗氧化肽制備的最佳酶解工藝。

表1　酶解反應(yīng)因素水平表Table.1　Factors and levels of enzymatic hydrolysis

1.2.2性能指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1還原力的測(cè)定其反應(yīng)原理[9]為K3Fe（CN）6與抗氧化劑混合后被還原成K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6進(jìn)一步與Fe3+發(fā)生反應(yīng)生成綠色Fe4[Fe（CN）6]3，其在700nm波長處有較大的吸收，吸光值越大，則抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)。其測(cè)定方法[1]為：在15mL試管中分別加入糯米糠抗氧化肽樣品1mL、磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L pH6.6）2.5mL和1%鐵氰化鉀5mL。在50℃水浴中反應(yīng)20min，然后加入10%的三氯乙酸5mL，搖勻，吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL的 0.1%的三氯化鐵溶液，最后在700nm處測(cè)定吸光值。以樣品的吸光度值代表其抗氧化肽的還原力。

1.2.2.2羥基自由基的清除率測(cè)定配制濃度為9× 10-3mol/L的水楊酸-乙醇溶液、9×10-3mol/L雙氧水和9×10-3mol/L的硫酸亞鐵溶液。以75%乙醇為空白對(duì)照，分別加入1mL水楊酸-乙醇溶液，依次加入不同體積的糯米糠或米糠抗氧化肽樣品溶液、1mL硫酸亞鐵溶液和1mL雙氧水，加蓋搖勻，靜置1h，然后稀釋至10mL以終止反應(yīng)，最后在510nm下測(cè)定吸光度值。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100（A和A0分別表示加入樣品溶液和空白液后的吸光度值）。

1.2.2.3超氧陰離子的清除率測(cè)定配制0.1mol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按表2加樣后迅速混勻，在320nm下每隔30s讀取吸光度，反應(yīng)4.5min結(jié)束[6]。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A和A0分別表示加入抑制物和雙蒸水后的鄰苯三酚的自氧化速率，即每分鐘光吸收的平均變化率。

表2　活性肽清除O2-·加樣表Table.2　Sample table of antioxidant peptides for scavenging O2-·

2　結(jié)果與討論

2.1糯米糠抗氧化肽制備的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同糯米蛋白底物濃度對(duì)還原力的影響按1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖1。

圖1　底物濃度對(duì)糯米糠抗氧化肽還原力的影響Fig.1　Effect of different concentration of substrate on reducing power

由圖1可知，隨著底物濃度增加，所得抗氧化肽的還原力呈現(xiàn)先增加后降低以至平緩的變化趨勢(shì)；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到3%時(shí)，還原能力達(dá)到最大。這是因?yàn)榈孜餄舛冗^低，酶與底物結(jié)合幾率低，制備的抗氧化肽較少，還原力偏低；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾?，酶與底物結(jié)合幾率增加，制備的抗氧化肽增多，還原力增強(qiáng)；

但底物濃度過大，底物分散困難，較多的底物相互包埋，反應(yīng)難度增加，導(dǎo)致抗氧化肽減少，還原力下降。所以，酶解適宜的底物濃度為3%。

2.1.2不同加酶量[E]/[S]對(duì)還原力的影響按1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2。

圖2　[E]/[S]對(duì)糯米糠抗氧化肽還原力的影響Fig.2　Effect of different dosage of[E]/[S]on reducing power

由圖2可知，隨著[E]/[S]的增加，所得抗氧化肽的還原力呈現(xiàn)先增加后降低以至趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)；當(dāng)[E]/[S]為2%時(shí)，還原力達(dá)到最大。這是因?yàn)樵谝欢ǖ姆磻?yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著[E]/[S]的增加，酶的活性基團(tuán)增加，加速了酶促反應(yīng)，制備的抗氧化肽增多，還原力增加；但是若[E]/[S]增加過多，酶促反應(yīng)過快，水解度過大，具有抗氧化活性的肽段被水解，破壞了維持其抗氧化活性的結(jié)構(gòu)上的完整特征[5]，導(dǎo)致抗氧化肽還原力降低。所以，酶解工藝適宜的[E]/[S]在2.0%左右。

2.1.3不同pH對(duì)還原力的影響按1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖3。

圖3　pH對(duì)糯米糠抗氧化肽還原力的影響Fig.3　Effect of different pH on reducing power

由圖3可知，糯米糠抗氧化肽的還原力隨著pH的增加呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢(shì)，在pH=7.0時(shí)，還原力最強(qiáng)。這是因?yàn)橹行缘鞍酌傅乃夥磻?yīng)適宜在中性條件下進(jìn)行。因此，酶解工藝適宜的pH在7.0左右。

2.1.4不同酶解溫度對(duì)還原力的影響按1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖4。

圖4　酶解溫度對(duì)糯米糠抗氧化肽還原力的影響Fig.4　Effect of different reaction temperature on reducing power

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，糯米糠抗氧化肽的還原力呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，還原力達(dá)到最大值。這是因?yàn)槊附鉁囟容^低時(shí)，酶活力增強(qiáng)，體系粘度降低，擴(kuò)散系數(shù)增大，有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，所得抗氧化肽的還原力增加；但是，當(dāng)酶解溫度過高時(shí)，將引起酶受熱變性，反應(yīng)能力下降，導(dǎo)致制備的抗氧化肽還原力降低。所以，適宜的酶解溫度在40℃左右。

2.1.5不同酶解時(shí)間對(duì)還原力的影響按1.2.1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖5。

由圖5中可知，隨著酶解時(shí)間的增加，糯米糠抗氧化肽的還原力隨之增強(qiáng)，當(dāng)酶解時(shí)間超過5h后，其還原力有所下降。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間影響了水解度，酶解時(shí)間過長，水解度過大，具有抗氧化活性的肽段被水解，導(dǎo)致抗氧化肽還原力下降。所以，適宜的酶解時(shí)間在5h左右。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)糯米糠抗氧化肽還原力的影響Fig.5　Effect of different reaction time on reducing power

2.2糯米糠抗氧化肽制備的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表Table.3　Analysis of the orthogonal experimental results

根據(jù)表3的極差分析可知，因素主次順序?yàn)椋篈＞B＞E＞D＞C，即影響糯米糠抗氧化肽還原力的因素主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋镜孜餄舛龋緋H＞酶解時(shí)間＞加酶量，最佳酶解條件是A2B3C2D4E3，即酶解溫度為40℃、底物濃度為4%、[E]/[S]為2%、酶解時(shí)間為6h、pH為7.0；在此條件下，還原力測(cè)定的吸光度0.819，高于表3的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

2.3糯米糠抗氧化肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力

以米糠為對(duì)照，在上述最佳工藝條件下分別制備糯米糠和米糠抗氧化肽，進(jìn)行羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6　抗氧化肽對(duì)羥基和超氧陰離子自由基的清除能力Fig.6　Scavenging activities on·OH and O2-·free radicals ofantioxidant peptide

由圖6可知，米糠和糯米糠抗氧化肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率均隨用量的增加而增大，存在一定的量效關(guān)系，且糯米糠抗氧化肽對(duì)羥基和超氧陰離子自由基的清除能力均明顯優(yōu)于米糠抗氧化肽，可能的原因是糯米糠和米糠蛋白在中性蛋白酶水解下產(chǎn)生了不同結(jié)構(gòu)或肽鏈的活性多肽，導(dǎo)致二者的自由基清除能力出現(xiàn)明顯差異。有關(guān)糯米糠抗氧化肽的純化和肽鏈結(jié)構(gòu)鑒定研究，有待另文進(jìn)一步報(bào)道。

3　結(jié)論

綜上所述，本文以中性蛋白酶為水解用酶，以抗氧化肽還原力為指標(biāo)，考察糯米蛋白底物濃度、加酶量、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等因素對(duì)糯米糠抗氧化肽制備效果的影響，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝。結(jié)果表明，糯米糠抗氧化肽的最佳制備工藝條件為糯米蛋白底物濃度4%、[E]/[S]2%、pH7、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間6h；在該條件下制備的糯米糠抗氧化肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力明顯優(yōu)于米糠抗氧化肽，且存在一定的量效關(guān)系，提示糯米糠抗氧化肽可用作功能性食品或天然抗氧化劑被深入研究和開發(fā)利用。

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Study on preparation technology and free radical scavenging capability of antioxidant peptide from glutinous rice bran

LI Li-hua1，YIN Zhong-yi2，ZHENG Xu-xu1，2，*
（1.Environmental and Biological Engineering Institute，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2.Chongqing Key Lab of Catalysis&Functional Organic Molecules，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China）

The optimum preparation process of antioxidant peptide from glutinous rice bran and its free radical scavenging capability were studied to exploit and utilize the resources of glutinous rice bran.Neutral protease was selected as hydrolytic enzyme，the single-factor experiment and the orthogonal tests were carried to optimize the preparation process of antioxidant peptide with reducing power of antioxidant peptide to an index. The results showed that the most optimum preparation condition of antioxidant peptides from glutinous rice bran protein with neutral protease were substance concentration 4%，[E]/[S]2%，pH 7，hydrolytic temperature 40℃ and time 6h.The scavenging activities to·OH and O2-·of antioxidant peptide from glutinous rice bran were stronger than which from rice bran，and their concentration and scavenging rate were definite dose-effect relationship，indicating the antioxidant peptide from glutinous rice bran could be used as functional food or natural antioxidants and be in-depth researched and developed and utilized.

glutinous rice bran；antioxidant peptide；enzymolysis；free radical scavenging capability

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.046

2014－06－19

李俐樺（1987-），女，碩士研究生，主要從事廢棄生物質(zhì)資源化利用方面的研究。

鄭旭煦（1964-），女，博士，教授，主要從事生物資源與天然藥物方面的研究。

重慶市百名學(xué)術(shù)學(xué)科領(lǐng)軍人才培養(yǎng)計(jì)劃（渝教人[2011]60號(hào)）。