蓮藕多酚的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

覃海明，艾有偉，易　陽

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

蓮藕多酚的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

覃海明，艾有偉，易陽*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

通過單因素實驗確定了乙醇濃度、料液比、pH、溫度和時間對蓮藕多酚浸提得率的影響，并建立了乙醇濃度、料液比、pH和時間的四因素回歸模型?；陧憫?yīng)面分析和實際應(yīng)用考慮，確定蓮藕多酚的超聲波提取工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶22、pH3、時間72min，浸提得率預(yù)測值為0.22%，實際值為0.23%。在該條件下，蓮藕多酚粗提物得率為1.12g/100g鮮重，其中多酚含量為19.73mg GAE/100mg干重。蓮藕多酚粗提物的DPPH自由基清除IC50值為351.56μg/mL，ABTS自由基清除IC50值為308.80μg/mL，F(xiàn)RAP抗氧化能力為0.21mg TE/mg粗提物，作為天然抗氧化劑應(yīng)用前景良好。

蓮藕，多酚，提取，抗氧化

蓮藕為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera G.）的肥大根莖，是我國種植面積最大且產(chǎn)量最高的水生蔬菜，主要分布在湖北、湖南和浙江等省[1]。蓮藕極為常見，但其清熱、止血、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、滋補安神等生理功效卻引人關(guān)注，且在多種古醫(yī)書和藥典中均有記載?；讦?胡蘿卜素/亞油酸乳化液法、FRAP法和DPPH法的化學(xué)抗氧化評價體系證實，蓮藕在常見的數(shù)十種蔬菜中表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[2-4]，而其抗氧化能力與酚類物質(zhì)含量成正比[5]。此外，蓮藕多酚及其提取物還能抑制金黃色葡萄球菌[6]、降血糖[7]、增強記憶力及神經(jīng)發(fā)育[8-9]。不同品種蓮藕的平均總酚含量約為117mg/100g鮮重[4]，主要由多巴、兒茶酚、沒食子酸、D-（+）-兒茶素和L-（-）-表兒茶素等組成[10]。作為蓮藕的主要功能活性成分，多酚的制備開發(fā)對促進產(chǎn)業(yè)精深加工并延展產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

目前，關(guān)于蓮藕多酚的提取工藝仍限于單純的溶劑浸提，多酚的相對得率不高[6，11]。超聲波輔助在植物多酚類物質(zhì)的提取研究中應(yīng)用廣泛，產(chǎn)生的熱作用、機械作用和空化效應(yīng)不僅能有效促進游離態(tài)多酚的溶出[12]，還可能釋放與細胞壁通過酯鍵結(jié)合的結(jié)合態(tài)多酚，顯著提高多酚提取率。本實驗采取響應(yīng)面優(yōu)化蓮藕多酚的超聲波輔助浸提工藝，并通過體外化學(xué)體系評價提取物的抗氧化活性，旨為蓮藕多酚的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮九孔蓮藕由武漢世林福幸科技發(fā)展有限公司蔡甸蓮藕基地提供，洗凈后整藕切塊粉碎，混勻后置于-20℃貯存?zhèn)溆?；沒食子酸（Gallic acid）、水溶性維生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ） 東京化成工業(yè)株式會社；福林酚試劑、醋酸鈉、過硫酸鉀、三氯化鐵、乙醇、乙酸等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

SB-5200DNT超聲波清洗儀寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-25型pH計上海虹益儀器儀表有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計日本島津有限公司；電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2蓮藕多酚的提取

1.2.1蓮藕多酚的提取測定取粉碎蓮藕渣3.0g，加入一定料液比的乙醇溶液，置于控溫的200W超聲場中持續(xù)浸提。浸提完成后，過濾分離濾液，并定容至100mL，混勻后測定多酚濃度。

1.2.2蓮藕粗多酚的制備將優(yōu)化的工藝參數(shù)放大30倍提取蓮藕多酚，浸提液過濾濃縮后，經(jīng)真空冷凍干燥得到粉末狀的淺黃色多酚粗提物。

1.3多酚含量測定與計算

多酚含量參考文獻[13]，多酚含量以沒食子酸當(dāng)量（GAE）表示。多酚浸提得率（%）以浸提液中多酚GAE占原料濕重的百分比表示。粗提物中多酚含量（mg GAE/100mg DW）以多酚GAE與樣品的質(zhì)量比表示。

1.4蓮藕多酚提取的單因素實驗

1.4.1乙醇濃度（乙醇體積比濃度）的確定乙醇濃度0、20%、40%、60%、80%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，溫度40℃，時間20min。

1.4.2料液比的確定乙醇濃度40%，料液比（g/mL）1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，pH4，溫度40℃，時間20min。

1.4.3pH的確定乙醇濃度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH2、3、4、5、6，溫度40℃，時間20min。

1.4.4溫度的確定乙醇濃度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，溫度20、30、40、50、60℃，時間20min。

1.4.5時間的確定乙醇濃度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，溫度40℃，時間5、10、20、40、60min。

1.5蓮藕多酚提取的響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken的中心組合設(shè)計安排四因素三水平實驗，優(yōu)化確定蓮藕多酚的最佳提取工藝條件，實驗因素及水平見表1。

1.6蓮藕多酚粗提物的抗氧化活性評價

1.6.1DPPH自由基清除能力蓮藕多酚粗提物經(jīng)40%乙醇溶解并稀釋成合適濃度梯度。取50μL樣液加入0.7mL DPPH溶液（100μmol/L）中混勻作為實驗組，以50μL的40%乙醇混合0.7mL DPPH溶液作為空白對照。避光保存30min后，于517nm處測定吸光值。DPPH自由基清除率（%）=（1-A實驗組/A空白對照）×100[14]。

1.6.2ABTS自由基清除能力蓮藕多酚粗提物的ABTS自由基清除能力參考文獻[13]的方法測定。取50μL樣液加入1mL ABTS溶液中混勻作為實驗組，以40%乙醇作為空白。室溫下避光靜置30min后于波長734nm下測其吸光值。ABTS自由基清除率（%）=（1-A實驗組/A工作液）×100。

表1　實驗因素和水平Table.1　Factors and levels of the experiment

1.6.3FRAP抗氧化能力蓮藕多酚粗提物的FRAP抗氧化能力參考文獻[13]的方法測定。粗多酚的FRAP抗氧化能力以每毫克粗提物對應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示（mg Trolox equivalents/mg，mg TE/mg）。

1.7數(shù)據(jù)處理

多因素實驗設(shè)計和響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析采用SAS（V8）軟件處理。組間數(shù)據(jù)差異比較采用SPSS11.5軟件S-N-K檢驗分析，顯著性水平為p＜0.05。圖中不同小寫英文字母表征0.05水平的顯著性差異。實驗及檢測均平行重復(fù)三次。

2　結(jié)果與分析

2.1蓮藕多酚提取的單因素實驗結(jié)果

2.1.1多酚測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測定多酚含量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y= 0.016x+0.062（R2=0.998），其中y為吸光值，x為沒食子酸濃度（μg/mL）。

2.1.2乙醇濃度對多酚浸提得率的影響多酚是一類極性范圍相對較寬的化合物，而浸提溶劑極性與多酚極性相當(dāng)時，有利于多酚的提取。不同濃度乙醇溶液的極性大小存在差異，對蓮藕多酚浸提得率的影響如圖1所示。多酚浸提得率隨乙醇濃度增加先增大后減小，乙醇濃度介于20%～60%間的浸提得率（0.16%～0.18%）無顯著差異（p＞0.05），但均顯著高于純水和80%乙醇溶液（p＜0.05）。蓮藕多酚提取相關(guān)研究文獻選擇的乙醇濃度范圍為40%～60%[6，11，15]，與本研究結(jié)果較為吻合。故蓮藕多酚浸提的乙醇濃度選定為20%～60%。

2.1.3料液比對多酚浸提得率的影響由圖2可見，料液比1∶5時的多酚浸提得率僅為0.15%，顯著低于其他實驗組（p＜0.05）。料液比1∶10和1∶15時的多酚浸提得率無明顯差異（p＞0.05），但均顯著低于料液比1∶20（p＜0.05）。隨著料液比的進一步減小，多酚浸提得率并未出現(xiàn)顯著增加（p＞0.05）。故蓮藕多酚浸提的料液比范圍選定為1∶15～1∶25。

2.1.4pH對多酚浸提得率的影響pH對蓮藕多酚浸提得率的影響如圖3所示，隨著pH的增加，多酚浸提得率先增大后減小。但pH介于2～5之間的多酚浸提得率變化并不顯著（p＞0.05），而pH3時的得率顯著高于pH6（p＜0.05）。植物組織內(nèi)多酚一部分以游離形式存在于液泡中，一部分與蛋白質(zhì)和多糖通過氫鍵或疏水鍵結(jié)合存在于細胞壁中[12]，而酸性條件有利于結(jié)合酚的釋放。故蓮藕多酚浸提的pH范圍選定為2～3。

圖1　乙醇濃度對蓮藕多酚浸提得率的影響Fig.1　Effect of ethanol volume percent on the extraction yield of polyphenol from lotus root

圖2　料液比對蓮藕多酚浸提得率的影響Fig.2　Effect of material-to-solvent ratio on the extraction yield of polyphenol from lotus root

圖3　pH對蓮藕多酚浸提得率的影響Fig.3　Effect of pH on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.1.5溫度對蓮藕多酚浸提得率的影響一般而言，溫度越高越利于植物材料中多酚的溶出和擴散，并增加其溶解度，能有效提高多酚的浸提得率。但在蓮藕多酚浸提過程中，超聲波的輔助作用可能屏蔽了溫度的影響，以致溫度在20～60℃范圍內(nèi)對蓮藕多酚浸提得率無顯著影響（p＞0.05），如圖4所示。故蓮藕多酚浸提在室溫下進行即可。

圖4　溫度對蓮藕多酚浸提得率的影響Fig.4　Effect of temperature on the extraction yield ofpolyphenol from lotus root

2.1.6時間對蓮藕多酚浸提得率的影響由圖5可見，蓮藕多酚浸提得率隨浸提時間延長顯著增加（p＜0.05）。超聲波浸提時間越長，對物料的作用越充分，多酚溶出量持續(xù)增加。但超聲波處理20min后，多酚浸提得率隨時間延長而增加的幅度減小。此外，超聲波處理時間過長，可能導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)破壞[16]，且能耗較高。故蓮藕多酚浸提的時間選定為20～60min。

圖5　時間對蓮藕多酚浸提得率的影響Fig.5　Effect of time on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.2蓮藕多酚提取的響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1回歸模型檢驗響應(yīng)面實驗安排及結(jié)果如表2所示。以乙醇濃度X1、料液比X2、pH X3、浸提時間X4為實驗因素，建立以蓮藕多酚浸提得率Y為考察指標(biāo)的回歸模型：Y=0.2100+0.0026X1+0.0096X2-0.0021X3+ 0.0138X4-0.0159X12-0.0018X1X2-0.0014X1X3-0.0015X1X4-0.0154X22+0.0067X2X3+0.0011X2X4-0.0124X32+0.0004X3X4-0.0044X42。

方差分析結(jié)果表明（表3），考察指標(biāo)Y的決定系數(shù)R2值為96.32%，回歸達到極顯著水平（p＜0.0001）。逐項顯著性檢驗結(jié)果顯示，線性項和交互項對Y無顯著影響（p＞0.05），而平方項對其有極顯著影響（p＜0.0001）。各因素對蓮藕多酚浸提得率的影響程度依次為浸提時間＞料液比＞乙醇濃度＞pH，其中僅時間和料液比的影響顯著（p＜0.01）。

表2　實驗設(shè)計及結(jié)果Table.2　Experimental design and results

2.2.2雙因素交互作用分析由表3可知，僅交互項X2X3對Y有顯著影響（p＜0.01），其交互作用如圖6所示。將乙醇濃度和浸提時間固定在零水平：浸提得率隨pH或料液比的增大先增加后減??；隨著料液比的增加，浸提得率極值點由pH-0.30水平向0.15水平偏移；隨著pH的增加，極值點由料液比0.15水平向0.50水平偏移。

圖6　料液比和pH對蓮藕多酚浸提得率的交互影響Fig.6　Interaction of material-to-solvent ratio and pH on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.2.3最佳工藝條件優(yōu)化采用RSREG Procedure分析回歸模型得到一個極值點（Y=0.2229），該點各因子的編碼值為：X1=-0.0278、X2=0.3832、X3=0.0476、X4=1.6111，即最佳條件為乙醇濃度39.44%、料液比1∶21.92、pH 3.05、時間72.22min。時間編碼值超出實驗因素水平范圍，但與其他因素不存在交互作用，且浸提得率隨時間增加而增大，可能在72.22min后趨于穩(wěn)定或降低，與時間單因素結(jié)果吻合?？紤]實際應(yīng)用調(diào)整工藝條件為乙醇濃度40%、料液比1∶22、pH3、時間72min，在此條件下的浸提得率預(yù)測值為0.22%，實際值為0.23%。換算成多酚粗提物得率為1.12g/100g鮮重，多酚含量為19.73mg GAE/100mg干重多酚粗提物。

表3　回歸模型方差分析Table.3　Analysis of variance with regression model

2.3蓮藕多酚粗提物的抗氧化活性

由圖7可見，Trolox和蓮藕多酚粗提物的自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，兩者對DPPH自由基清除的IC50值分別為68.59μg/mL（y=0.724x+0.338，R2=0.998）和351.56μg/mL（y=0.132x+3.593，R2=0.996），而對ABTS自由基清除的IC50值分別為64.33μg/mL（y= 0.773x+0.273，R2=0.998）和308.80μg/mL（y=0.174x-3.731，R2=0.994）。在自由基半數(shù)清除條件下，1mg蓮藕多酚粗提物僅相當(dāng)于約0.20mg Trolox。此外，通過Trolox的FRAP抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程為y= 0.0059x+0.0019，R2=0.997，其中y為吸光值，x為Trolox濃度），測定蓮藕多酚粗提物的FRAP抗氧化能力為0.21mg TE/mg（表4）。以40%乙醇作為溶劑提取蓮藕多酚的同時，具有抗氧化活性的低分子量多糖或多糖蛋白復(fù)合物可能隨之溶出[4]，但其抗氧化能力相比多酚類物質(zhì)較弱。嚴(yán)守雷分離得到蓮藕多酚組分I和組分II的純度分別為40.93%和14.12%，兩者對羥基自由基的清除IC50值分別為0.387%和2.572%[6]，說明多酚粗提物抗氧化活性可能與其多酚含量有密切關(guān)聯(lián)，借此推測高純度蓮藕多酚提取物的抗氧化活性可能與Trolox相當(dāng)。油脂中加入蓮藕多酚能顯著降低其氧化水平，延長貯藏期[6，11]。另外，蓮藕多酚還能抑制H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細胞氧化溶血，減少小鼠肝勻漿MDA生成及肝線粒體腫脹[15]。由此可見，蓮藕多酚粗提物在化學(xué)及生物體系中均表現(xiàn)出有效的抗氧化功能，用于食品品質(zhì)維持和功能食品開發(fā)前景廣闊。

圖7　蓮藕多酚粗提物的自由基清除能力Fig.7　The free radical scavenging ability of crude polyphenol extract from lotus root

表4　蓮藕多酚粗提物的抗氧化活性Table.4　The antioxidant activities of crude polyphenol extract from lotus root

3　結(jié)論

結(jié)合單因素實驗和響應(yīng)面實驗，以浸提得率為指標(biāo)優(yōu)化蓮藕多酚的超聲波提取工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶22、pH3、時間72min。在該條件下的蓮藕多酚實際浸提得率為0.23%，與預(yù)測值的差異小于5%，而蓮藕多酚粗提物得率為1.12g/100g鮮重。該粗提物中多酚含量為19.73mg GAE/100mg干重，其DPPH自由基清除IC50值為351.56μg/mL，ABTS自由基清除IC50值為308.80μg/mL，F(xiàn)RAP抗氧化能力為0.21 mg TE/mg粗提物。蓮藕多酚作為天然抗氧化劑具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景，但本研究中粗提物的多酚含量較低，其抗氧化活性偏弱，需進一步分離純化提高純度，且單體酚組成有待解析。

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Extraction optimization and antioxidant evaluation of polyphenol from lotus root

QIN Hai-ming，AI You-wei，YI Yang*
（College of Food Science&Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

The effects of ethanol volume percent，material-to-solvent ratio，pH，extraction temperature and time on the extraction yield of polyphenol were investigated by single-factor experiment.Then，ethanol volume percent，material-to-solvent ratio，pH and extraction time were selected to establish the regression mathematical model with four factors.Based on response surface analysis and practical consideration，the optimized conditions were confirmed to be follows：ethanol volume percent was 40%，material-to-solvent ratio was 1∶22（g/mL），pH was 3 and extraction time was 72min.Accordingly，the predicted polyphenol yield was 0.22%，the tested polyphenol yield was 0.23%.Under these conditions，the yield of crude polyphenol extract was 1.12g/100g fresh weight，and the polyphenol content in the extract was 19.73mg GAE/100mg dry weight.The crude polyphenol extract showed application prospect as a natural antioxidant because of significant antioxidant activities involving in the IC50value of DPPH free radical scavenging was 351.56μg/mL，the IC50value of ABTS free radical scavenging was 308.80μg/mL，the FRAP antioxidant ability was 0.21mg TE/mg extract.

lotus root；polyphenol；extraction；antioxidant acivity

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.044

2014－05－12

覃海明（1994-），女，本科，研究方向：蓮藕功能成分分析評價。

易陽（1986-），男，博士，講師，研究方向：果蔬活性成分。

武漢輕工大學(xué)校立科研項目（2013D16、2013RZ03）。