蘋果枝條多酚分離純化及其抗氧化活性研究

陳瑋琦，郭玉蓉，*，張　娟，張曉瑞

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062）

蘋果枝條多酚分離純化及其抗氧化活性研究

陳瑋琦1，郭玉蓉1，*，張娟2，張曉瑞3

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062）

研究了6種大孔樹脂對蘋果枝條多酚的吸附性能，篩選出分離蘋果枝條多酚的最佳樹脂為X-5，進一步研究X-5大孔樹脂純化多酚的工藝條件和技術(shù)參數(shù)。所得最佳純化工藝為：上樣濃度為1mg/mL，流速為1.0BV/h，pH5.0，以70%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為2.0BV/h。在此條件下，所得蘋果枝條多酚的純度為72.36%，提取率為0.82%。對純化后的蘋果枝條多酚抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明：蘋果枝條多酚具有較強的還原能力，對羥基自由基、DPPH自由基具有良好的清除能力。

蘋果枝條，多酚，大孔樹脂，抗氧化

中國是世界最大的蘋果生產(chǎn)國，在東北、華北、華東、西北和四川、云南等地均有栽培，栽培面積近189萬平方公里，我國蘋果的栽培面積和產(chǎn)量分別占世界總栽培面積和總產(chǎn)量的37%和40%，每年由于果樹修剪等原因產(chǎn)生大量的蘋果樹枝和葉片得不到廣泛的綜合利用[1]。蘋果枝條中含有大量的多酚類物質(zhì)，其中根皮苷的含量高達64.32mg/g[2]；研究表明，根皮苷具有良好的防輻射，抑制脂肪氧化[3]、改善記憶力及美容美白等功效，并且對治療糖尿病、代謝綜合癥及神經(jīng)性疾病也有良好療效[4-5]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學、食品行業(yè)及化妝品行業(yè)。

現(xiàn)今多酚的提取方法日益精進，大多使用有機溶劑得到的粗提物中多酚的純度較低。使用粗提物為原料進行應(yīng)用，因有效成分含量較低而影響其發(fā)揮應(yīng)有生理活性。大孔樹脂是一種多孔性高分子吸附分離材料，比表面積很大，具有選擇性強、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等優(yōu)點[6]。近幾年來在多酚類物質(zhì)的分離純化中應(yīng)用越來越廣泛，Lijun Sun等[7]利用大孔樹脂分離純化蘋果幼果多酚，純化后，多酚純度增加一倍。大孔樹脂還被應(yīng)用于純化葡萄籽多酚[8]和石榴皮多酚[9]，均表現(xiàn)出較好的分離純化效果。本文以蘋果枝條為原料研究了6種大孔樹脂對蘋果枝條多酚的吸附及解吸性能，同時采用亞鐵還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）法、DPPH法及清除的羥基自由基（·OH）的方法初步研究蘋果枝條多酚的抗氧化活性，為實現(xiàn)其工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冬季修剪（2012年11月中旬）的蘋果枝條采摘自陜西省咸陽市禮泉縣；AB-8、X-5、NKA-9、D101、D110、D4020 6種大孔吸附樹脂西安晶博生物有限公司；鄰二氮菲、鄰苯三酚天津光復(fù)精細化工研究所；沒食子酸標準品、福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2，2-Diphenyl-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]美國sigma公司；其余所用試劑均為分析純。

WFJ2100型可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；LAC164型電子分析天平梅特勒—托利多（上海）儀器有限公司；FW100型高速萬能植物粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；DD-5M型醫(yī)用離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2實驗方法

1.2.1蘋果枝條提取物的制備準確稱取蘋果枝條干粉100.00g，加入70%乙醇溶液（料液比為1∶10），超聲波輔助提取45min，過濾，另加入70%乙醇溶液提取，總共提取3次，合并濾液并將濾液減壓蒸發(fā)至無醇味，4000r/min離心20min，取上清液，儲存于0～4℃冰箱中，備用。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理將AB-8、X-5、NKA-9、D101、D110、D4020大孔樹脂依次用一定量純凈水漂洗，再用95%乙醇浸泡活化24h，后用蒸餾水沖洗至無醇味，用2～3倍樹脂體積的5%鹽酸溶液浸泡，后用水洗到接近中性，再用2～4倍樹脂體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性，濕法裝柱。

1.2.3大孔樹脂的篩選準確稱取經(jīng)預(yù)處理的6種樹脂各3.000g，放置于磨口具塞三角瓶中，準確加入100mL濃度為47.5μg/mL的蘋果枝條多酚提取液，吸附24h，取濾出后的樹脂，加入70%的乙醇溶液100mL置于室溫振蕩洗脫2h，采用Folin-Ciocalteu法[10]測定吸附液和洗脫液中總酚濃度，按照以下公式計算其吸附量、洗脫率、吸附率，綜合評價所選6種樹脂的吸附洗脫性能，最終篩選出最適宜的樹脂進行后續(xù)實驗研究[11]。

其中：Q為吸附量，mg/g；R為樹脂的吸附率，%；T為樹脂的解析率，%；C0為起始時的質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為平衡時的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為吸附液的體積，mL；W為加入樹脂的質(zhì)量，g；C1為解吸液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

1.2.4靜態(tài)吸附、洗脫實驗

1.2.4.1樹脂靜態(tài)吸附動力學研究稱取經(jīng)篩選后的樹脂3.000g，加入總多酚濃度為2.0mg/mL的蘋果枝條多酚提取液100mL，24h內(nèi)每1h取一次樣測定剩余液體中的總多酚含量，通過計算樹脂的吸附量繪制樹脂對多酚的吸附量隨時間的變化曲線。

1.2.4.2提取液pH對吸附效率的影響調(diào)節(jié)100mL總酚含量為2.0mg/mL的蘋果枝條多酚提取液的pH分別為2、3、4、5、6、7、8，各加入篩選出的樹脂2.000g，靜置于室溫下吸附24h，使之達到吸附平衡，然后測定不同pH下樹脂的吸附量。

1.2.4.3乙醇濃度對洗脫效果的影響準確稱取8份經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂2.000g，置于150mL具塞三角瓶中，分別加入100mL總酚含量為4.750mg/g的蘋果枝條多酚提取液，置于室溫下靜態(tài)吸附24h，待達吸附平衡后，計算吸附量。分別以濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%（v/v）的乙醇溶液100mL室溫下振蕩洗脫2h，達吸附平衡后通過測定洗脫液中的總酚含量來比較不同濃度乙醇溶液的洗脫效果。

1.2.4.4溫度對洗脫效果的影響準確稱取8份經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂1.000g，置于150mL具塞三角瓶中，各加入總多酚含量為4.750mg/g的多酚提取液50mL，于室溫下靜態(tài)吸附24h，使之達到吸附平衡，測定吸附液中總酚含量，計算吸附量，過濾達到吸附平衡的樹脂，用蒸餾水洗去表面殘留的多酚溶液，再以濃度為70%（v/v）的乙醇溶液100mL在20、30、40、50、60、70℃下振蕩洗脫30min，通過測定洗脫液中總酚含量計算洗脫率，比較溫度對洗脫效果的影響。

1.2.5動態(tài)吸附、洗脫實驗

1.2.5.1多酚溶液上柱流速對吸附效果的影響將濃度為1.0mg/mL的多酚提取液，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5BV/h的流速進入柱體積約為500mL的X-5樹脂柱中進行吸附實驗，每隔一定柱體積的流出液，測定收集點上多酚的濃度。

1.2.5.2多酚溶液上柱濃度對吸附效果的影響將濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的多酚提取液，以1.0BV/h的流速進入柱體積約為500mL的X-5樹脂柱中進行吸附實驗，每隔一定柱體積的流出液，測定收集點上多酚的濃度。

1.2.5.3洗脫流速對洗脫效果的影響將500mL濃度為1.0mg/mL，pH為5.0的多酚提取液，用60%的乙醇分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0BV/h的流速進行洗脫，考察洗脫流速對洗脫效果的影響。

1.2.6蘋果枝條多酚體外抗氧化活性實驗

1.2.6.1總還原力的測定在10mL試管中分別加入不同濃度（20、40、60、80、100μg/mL）的蘋果枝條多酚溶液1mL，PBS（0.2mol/L，pH=6.6）0.5mL和0.3%鐵氰化鉀1.5mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20min，然后加入10%的三氯乙酸10mL，混勻后準確吸取上清液2mL，加入0.5mL 0.3%三氯化鐵溶液，搖勻后在700nm處測定吸光值[12]。

1.2.6.2對羥自由基的清除作用采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2[13]法，將1.5mL不同濃度多酚溶液加入1.5mL PBS（0.2mol/L，pH=7.4）、1.5mL鄰二氮菲溶液（1mmol/L）、1mL硫酸亞鐵（1.5mmol/L）溶液和0.01%的過氧化氫溶液的混合液中，再加入蒸餾水將體積補至6mL，然后將各試管搖勻放入37℃恒溫水浴鍋中保溫1h后測定其在509nm處的吸光值。各管對羥基自由基的清除率（SA）按下式計算：

SA（%）=（A1-A2）/（A0-A1）×100

式中：A0表示未損傷管（1.5mL的磷酸鹽緩沖液+ 1.5mL鄰二氮菲溶液+1mL硫酸亞鐵溶液）；A1表示損傷管（1.5mL的磷酸鹽緩沖液+1.5mL鄰二氮菲溶液+ 1mL硫酸亞鐵溶液+1mL的樣品溶液+1mL雙氧水溶液）；A2表示樣品管（1.5mL的磷酸鹽緩沖液+1.5mL鄰二氮菲溶液+1mL硫酸亞鐵溶液+1mL雙氧水溶液）；SA為樣品對羥基自由基的清除率，%。

1.2.6.3對DPPH自由基的清除作用配制60μmol/L的DPPH乙醇溶液，取2mL DPPH溶液，分別加入0.2mL不同濃度蘋果枝條多酚溶液，搖勻，置于25℃水浴中反應(yīng)15min后取出，測定525nm波長下的吸光值，以2mL 50%乙醇作為空白對照管，以2mL 50%乙醇代替DPPH溶液作為樣品參比管，并以等體積蒸餾水和50%乙醇混合溶液空白調(diào)零測定其吸光值[14]。各管對DPPH的清除率（SA）按照下式計算：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）]/Ac×100

其中：SA表示對自由基的清除率，%；Ai表示樣品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度；Aj表示未加DPPH溶液的樣品溶液的吸光度；Ac表示未加樣品時DPPH溶液的吸光度。

蘋果枝條多酚抗氧化性實驗均選用VC和BHT為陽性對照。

1.3數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

以上實驗均做三次重復(fù)。實驗結(jié)果采用“SPSS 13.0”統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，Excel軟件制表繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.16種大孔吸附樹脂對蘋果枝條多酚的吸附和解吸性能

綜合分析表1可知，X-5樹脂在所選的6種大孔樹脂中的吸附率和洗脫率最高，可選擇X-5樹脂為最佳吸附分離載體。D101樹脂的吸附率及解析率最小，此現(xiàn)象說明大孔樹脂對蘋果枝條多酚的吸附有較強的選擇性，吸附能力的大小與樹脂的類型有關(guān)。綜合考慮，選用X-5樹脂對蘋果枝條多酚進行分離純化。

表1　6種大孔吸附樹脂的物理參數(shù)和吸附及解吸性能Table.1　Comparison of physical index and adsorption-desorption properties of six resins

2.2靜態(tài)吸附、洗脫實驗

2.2.1X-5樹脂吸附曲線繪制由圖1可以看出，X-5樹脂在0～5h內(nèi)對蘋果枝條多酚的吸附量隨著時間的延長不斷增加，8h以后，隨著時間的繼續(xù)延長，解析率變化不大，此時因X-5大孔樹脂吸附近飽和，基本上達解吸平衡狀態(tài)。

圖1　X-5樹脂吸附曲線Fig.1　Absorbing curve of X-5 resin

2.2.2提取液pH對吸附效果的影響提取液pH對X-5樹脂靜態(tài)吸附的影響如圖2所示。蘋果枝條多酚溶液的pH對樹脂的吸附有較大影響，當多酚溶液的pH為5.0時，樹脂對蘋果枝條多酚的吸附量達最大。X-5樹脂對蘋果枝條多酚的吸附率呈先升高后下降的趨勢，這可能是因為在微酸性環(huán)境下，酚類物質(zhì)以分子態(tài)存在，易于被識別并吸附，而在堿性的環(huán)境中，酚類物質(zhì)多轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子狀態(tài)，不利于樹脂吸附[15]。因此，選擇pH為5.0為宜。

圖2　樣品溶液pH對X-5樹脂吸附效果的影響Fig.2　Influence of sample solution pH on absorbingcharacteristics of X-5 resin

2.2.3乙醇濃度對X-5樹脂洗脫效果的影響由圖3可知，樹脂的洗脫率隨乙醇濃度的升高而升高，當乙醇濃度高于60%后洗脫率基本恒定，乙醇水溶液是一種良好的解吸劑。高濃度的乙醇雖有利于多酚的釋放，但同時也提高了生產(chǎn)成本，綜合考慮，選擇70%乙醇水溶液為合適的洗脫劑對樹脂動態(tài)吸附、洗脫進行研究。

圖3　乙醇濃度對洗脫效果的影響Fig.3　Influence of ethanol concentration on eluting effect

2.2.4溫度對X-5樹脂洗脫效果的影響圖4顯示的是X-5樹脂對蘋果枝條多酚吸附率隨溫度變化而變化的結(jié)果。樹脂的動態(tài)洗脫率隨溫度的增加而升高，X-5大孔樹脂在運輸貯存及使用過程中應(yīng)保持5～45℃環(huán)境中，避免過熱過冷，如圖4可見大于50℃時洗脫率基本不發(fā)生改變，但考慮到生產(chǎn)成本升高溫度對其洗脫率貢獻不大，故實驗條件選擇為室溫（25±2℃）。

圖4　溫度對洗脫效果的影響Fig.4　Influence of temperature on eluting effects

2.3動態(tài)吸附、洗脫實驗

2.3.1上柱多酚溶液流速對吸附效果的影響由圖5可以看出，隨著流出液體積的增大，流出液中殘留的多酚物質(zhì)也逐漸增加，這表明樹脂對提取液中多酚的吸附百分比逐漸降低；隨著流速的增大，多酚的漏過率也逐漸增大，吸附百分比下降的速率也逐漸升高，這表明較高的流速不利于多酚在樹脂上的吸附。且當流速為0.5BV/h時，流出液中殘留的多酚物質(zhì)少于流速為1.0BV/h殘留的多酚物質(zhì)，故將流速控制在1.0BV/h較好。

2.3.2上柱多酚溶液的濃度對吸附效果的影響圖6反映了不同濃度下流出液中多酚含量隨流出液體積的變化。從圖6可以看出，隨著蘋果枝條多酚提取液濃度的增大，流出液中殘留的多酚含量不斷增加；在較低濃度時，流出液中多酚的含量一直維持在一個較低水平，吸附百分比較高。因此，選擇較低的溶液濃度（1mg/mL）進行吸附，可獲得良好的吸附效果。

圖5　流速對X-5樹脂吸附效果的影響Fig.5　Influence of sample flow on absorbing effects of X-5 resin

圖6　多酚溶液濃度對X-5樹脂吸附效果的影響Fig.6　Influence of sample concentration on absorbing effects of X-5 resin

2.3.3洗脫流速對洗脫效果的影響洗脫流速對洗脫效果的影響如圖7所示，由圖7可知，洗脫流速越小其洗脫效果越好?？赡苁怯捎诹魉龠^快洗脫劑未與被吸附的多酚物質(zhì)充分接觸就流出，從而造成洗脫率較低。當流速為1BV/h時，洗脫率可達86.6%。但是洗脫的速率過慢，花費時間較長，效率低。綜上所述，選擇洗脫流速2BV/h為宜。

圖7　洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.7　Effect of eluent rate on desorption property

根據(jù)以上條件進行驗證，得到蘋果枝條多酚的純度為72.36%，提取率為0.82%。

2.4蘋果枝條多酚體外抗氧化性功能實驗

2.4.1蘋果枝條多酚總還原能力蘋果枝條多酚、BHT和VC的總還原能力如圖8所示，在選取的實驗濃度范圍內(nèi)（20～100μg/mL），隨著質(zhì)量濃度的增加，其總還原力也隨之增加，說明蘋果枝條多酚、BHT及VC在適宜的濃度范圍內(nèi)均有較好的總還原能力，且蘋果枝條多酚的總還原能力顯著高于（p＜0.05）VC和BHT。BHT的總還原能力最弱。當濃度為100μg/mL時，蘋果枝條多酚反應(yīng)生成物在700nm處的吸光值分別是VC和BHT的1.2倍、2.03倍，綜上所述，蘋果枝條多酚具有較強的總還原能力。

圖8　樣品、BHT和VC的總還原能力Fig.8　Total reducing power of sample，BHT and VC

2.4.2蘋果枝條多酚對DPPH·的清除能力DPPH·（二苯三硝基苯肼）是一種有機自由基，具有穩(wěn)定性好、操作簡便等優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于評價物質(zhì)的抗氧化活性或篩選自由基清除劑[16]。分別選擇20、40、60、80、100μg/mL這5個質(zhì)量濃度的蘋果枝條多酚、BHT和VC進行清除DPPH·實驗，結(jié)果如圖9所示，蘋果枝條多酚，BHT和VC均具有清除DPPH自由基的作用，且隨質(zhì)量濃度的增加而增強。BHT的清除作用低于VC和蘋果枝條多酚，蘋果枝條多酚和抗壞血酸的清除能力相接近，差異不顯著（p＞0.05）。在實驗濃度范圍內(nèi)，蘋果枝條多酚的清除率最高達到97%，表現(xiàn)出良好的清除效果。

圖9　樣品、BHT和Vc對DPPH·自由基的清除作用Fig.9　Scavenging effects of sample，BHT and VCon DPPH·radical

2.4.3蘋果枝條多酚對羥基自由基的清除能力羥基自由基（·OH）是需氧生物代謝過程中生成的具有強氧化能力的氧自由基，因此可用清除羥自由基能力來反映受試物抗氧化性的強弱，大量研究[17-18]表明，自由基會造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，進而導致生物衰老和疾病的發(fā)生。蘋果枝條多酚、BHT和VC對羥基自由基的清除能力如圖10所示。從圖10中可知，蘋果枝條多酚和所選陽性對照對羥基自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高。在實驗濃度范圍內(nèi)（20～100μg/mL），蘋果枝條多酚對羥基自由基的清除率由31%上升到70%，高于BHT對羥基自由基的清除率，低于VC的清除率。

圖10　樣品、BHT和VC對羥基自由基的清除作用Fig.10　　Scavenging effects of sample，BHT and VCon hydroxyl free radical

3　結(jié)論

本研究選用蘋果樹枝為原料，通過分析6種大孔樹脂的吸附特性，篩選出X-5型樹脂為蘋果枝條多酚分離純化樹脂。上柱條件：上柱液多酚濃度1mg/mL，最佳pH為5，上柱液流速為1.0BV/h；解析條件：洗脫液體積分數(shù)為70%乙醇溶液，洗脫液流速為2.0BV/h。在此條件下，所得蘋果枝條多酚的純度為72.36%，提取率為0.82%。采用樹脂分離蘋果枝條多酚具有得率高、成本低、操作簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。

蘋果枝條多酚在實驗濃度范圍內(nèi)具有良好的抗氧化能力，其總還原力為VC和BHT的1.20倍、2.03倍，枝條多酚濃度為100μg/mL時，對DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為97%和70%，表現(xiàn)出良好的清除效果。

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Study on the extraction and purification of polyphenols from apple branch and their antioxidative activities

CHEN Wei-qi1，GUO Yu-rong1，*，ZHANG Juan2，ZHANG Xiao-rui3
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Adsorption and desorption properties of six kinds of macroporous resins were evaluated for isolation and purification of total polyphenols from apple branches.The results showed that X-5 resin was verified to offer the best adsorption capacity and desorption ratio for total polyphenols among the six macroporous resins investigated.Influential factors，such as pH and concentration of feeding solution，strippant，and adsorption isotherm polyphenols，were successively investigated on X-5 resin.The optimum technology were as follows， the sample concentration was 1mg/mL，the adsorption flow rate was 1BV/h，pH of the extracted solution was 5.0，the strippant was 70%ethanol，the elution flow rate was 2BV/h.Under the optimum conditions，the purity of total polyphenols increased to 72.36%and the yield was 0.82%.Antioxidative activities of purified polyphenol extracts from apple branches were also studied.The results indicated that polyphenol extracted from apple branches had a strong total reducing power activity and the free radical scavenging abilities on·OH，DPPH·were excellent.

apple branch；polyphenol；macroporous resin；antioxidation

TS201.2

B

1002-0306（2015）04-0231-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.042

2014－06－04

陳瑋琦（1989-），女，碩士研究生，主要從事食品功能成分開發(fā)及利用方面的研究。

郭玉蓉（1962-），女，博士，教授，主要從事食品生物加工方面的研究。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金資助（CARS-28）。