牛乳中腸膜明串珠菌AR66的降膽固醇抗氧化特性

馬　英，訾占超，劉長建

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京102618；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

牛乳中腸膜明串珠菌AR66的降膽固醇抗氧化特性

馬英1，訾占超1，劉長建2，*

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京102618；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

使用MRS培養(yǎng)基，從新鮮牛乳中分離得到1株生長良好的乳酸菌（AR66），經(jīng)菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株能產(chǎn)乳酸、革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株AR66為腸膜明串珠菌。腸膜明串珠菌AR66具有抗氧化活性，對羥自由基、DPPH和超氧陰離子的清除率與細(xì)胞濃度呈正相關(guān)。在細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時，未破碎細(xì)胞對羥自由基、超氧陰離子的清除率高于已破碎細(xì)胞的清除率，分別是49.76%和83.33%；已破碎細(xì)胞對DPPH自由基的清除率高于未破碎細(xì)胞的清除率，為77.09%。菌株AR66還具有清除培養(yǎng)基中44.73%的膽固醇。菌株AR66對我國未來益生菌功能食品的開發(fā)具有重要價值。

牛奶，明串珠菌屬，16S rDNA，系統(tǒng)發(fā)育樹，抗氧化作用

明串珠菌（Leuconostoc）屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）乳桿菌目明串球菌屬，常存在于蔬菜、甘蔗、飼料和多種發(fā)酵食品等各種植物材料中，還作為益生菌廣泛應(yīng)用于風(fēng)味酸奶、發(fā)酵奶油、干酪、Kefir乳等各種乳制品和功能性食品中，也在保持產(chǎn)品的質(zhì)量中起著重要作用[1]。同時明串珠菌的定植能影響宿主腸道相關(guān)淋巴組織、淋巴細(xì)胞功能和全身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；還能降低血液中的膽固醇，起到調(diào)節(jié)血脂的作用[2]。氧化作用是人體正常存在的，但是同時也帶來很大的危害[3]，癌癥、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、心血管等疾病都和自由基的作用有關(guān)[4-5]。目前食品中預(yù)防氧化主要是通過添加如BHA、BHT、PG等抗氧化劑，但是這些抗氧化劑存在成本高、抗氧化性能弱等問題，甚至還存在一些食品安全問題[5-6]。研究開發(fā)低廉、安全的天然抗氧化物已成為研究熱點(diǎn)。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌在長期進(jìn)化演變過程中具有顯著的抗氧化活性[5，7]。且動物源乳酸菌具有在胃腸道上更好的粘附性，能夠通過清除自由基和抑制脂質(zhì)氧化起到治療疾病的目的[7]。本研究從新采集牛乳中分離出一株明串珠菌，對其抗氧化活性等益生特性進(jìn)行了體外評估，為明串珠菌屬在這一方面的益生作用研究開發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛奶取自奶牛場3年齡奶牛，由無菌管帶回實(shí)驗(yàn)室；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）英國Johnson Matthey公司；膽固醇國藥集團(tuán)公司；PCR反應(yīng)所用的相關(guān)試劑均購于寶生物工程（大連）有限公司；分離用培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基（Merck）；其他培養(yǎng)基PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、含6.5%、18%NaCl的MRS培養(yǎng)基[8]和含0.10mg/mL高膽固醇液體培養(yǎng)基[9-10]。

CF15RX型高速冷凍離心機(jī)日本日立公司；LC-20A型液相色譜儀、UV-2450型分光光度計日本島津公司；MD200-2型氮吹儀杭州奧盛科技有限公司；DNP-9052型恒溫培養(yǎng)箱上海精宏儀器設(shè)備有限公司；JY92-IIN型超聲破碎儀寧波新芝生物有限公司；TC-512型基因擴(kuò)增儀英國Techne公司。

1.2乳酸菌的初步篩選

取1.0mL樣品連續(xù)稀釋后涂布于含碳酸鈣的分離固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24～48h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落，純化兩次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、高效液相檢測發(fā)酵產(chǎn)乳酸[9]、生長較好的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.3菌落形態(tài)、菌體細(xì)胞形態(tài)及生理生化特性

活化菌株接種MRS平板后，37℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落大小、顏色、邊緣形狀等菌落特征。菌體進(jìn)行革蘭氏染色后高倍顯微觀察菌體、細(xì)胞形狀、大小等特征。測定菌株在10℃和45℃的生長情況、耐鹽性、運(yùn)動性、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)等測試其生理生化特征[8]。

1.4菌株的分子生物學(xué)鑒定

將純化得到的菌種在37℃條件培養(yǎng)2d后，離心收集菌體；提取總DNA。采用通用引物F27和R1525對其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，測序后將序列輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中，與基因庫內(nèi)所有相關(guān)核酸序列進(jìn)行比較，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。

1.5乳酸菌抗氧化特性的測定

取培養(yǎng)36h的菌液8000r/min離心10min，無菌水洗滌3次，血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至109CFU/mL，所得菌懸液分為兩組，一組作為完整細(xì)胞組；另一組超聲破碎儀280W，間隔5s處理5s，顯微鏡下檢查沒有完整菌體為止。

1.5.1乳酸菌對羥自由基的清除活性測定[7，11]試管中加入0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）0.75mL，260μg/mL番紅花紅0.1mL。1.0mmol/L EDTA-Na2-Fe2+0.7mL，再加入0.5mL不同濃度菌液，最后加入2%H2O20.4mL，振蕩混勻后于37℃水浴30min。空白以蒸餾水代替試樣，對照管以3%H2O2代替樣品溶液與EDTA-Na2-Fe2+溶液，520nm波長處測吸光度。A試樣表示樣品的吸光值，A對照表示對照的吸光值，A空白表示空白的吸光值。清除率E（%）=（A試樣－A空白）/（A對照－A空白）×100。

1.5.2乳酸菌對DPPH自由基的清除活性測定[7，11]試管中加0.5mL不同濃度菌液，分別加1mL DPPH（0.16mmol/L）溶液，于25℃反應(yīng)15min，在最大波長525nm下測吸光度。清除率E（%）=（1－A試樣/A空）×100。

1.5.3乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除活性測定[7，11]取0.05mol/L pH=8.25 Tris-HCl緩沖液2.25mL于試管中，在25℃水浴鍋中預(yù)熱25min，加0.5mL不同濃度菌液，3mmol/L鄰苯三酚0.2mL，以Tris-HCl為空白管，混勻于25℃精確反應(yīng)4min，立即用0.25mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在最大波長320nm下測吸光度。清除率E（%）=（1－A試樣/A空）×100。

1.6乳酸菌的降膽固醇特性測定

將純化的菌株按接種量5%分別接種到4管高膽固醇液體培養(yǎng)基中，在37℃靜置培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、36、48、60h后，鄰苯二甲醛法測定膽固醇濃度[12-13]。取0.5mL菌液，加氫氧化鉀乙醇溶液皂化反應(yīng)，正己烷萃取；氮?dú)獯蹈珊蟊宜嶂匦氯芙猓秽彵蕉兹┍宜崛芤猴@色反應(yīng)，550nm條件下測吸光度值。膽固醇冰乙酸溶液（5、10、15、20、25μg/mL）與顯色液反應(yīng)后，與吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定膽固醇濃度（C1），同時測定培養(yǎng)初始的膽固醇濃度（C0），并按以下公式計算降解率：降解率（%）=（C0-C1）/ C0×100。

1.7數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析圖采用Excel 2007，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)（p＜0.05）。

2　結(jié)果與討論

2.1乳酸菌的初步篩選

從牛奶中共分離得到25個疑似菌株，接觸酶反應(yīng)為陰性的有10株，高效液相色譜法對發(fā)酵液的檢測結(jié)果表明10株均產(chǎn)乳酸。選取生長較好的一株AR66進(jìn)一步研究。

圖1AR66菌落形態(tài)（a）、菌體的革蘭氏染色顯微觀察（b）（100×）Fig.1　Colonies（a）andCells（b）morphologyofStrainAR66（100×）

2.2菌落形態(tài)及菌體細(xì)胞形態(tài)

如圖1、表1所示，菌株AR66在MRS固體培養(yǎng)基上37℃生長48h，形成的菌落直徑小于1mm，光滑圓形，乳白產(chǎn)黏，兼性厭氧。菌體染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，細(xì)胞均呈現(xiàn)紫色，判定菌株AR66為G+。菌體呈近球形、不產(chǎn)芽孢、沒有鞭毛。

2.3乳酸菌生理生化特性測定

由表1可知，菌株AR66接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性，不能水解淀粉，V-P、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)陰性；能水解七葉苷，能耐受6.5%和18%NaCl。菌株AR66不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、肌醇、纖維二糖、蜜二糖、核糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。

表1　乳酸菌AR66的形態(tài)和生理生化特性Table.1　Morphological and biochemical characteristics of strain AR66

2.416S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株AR66總的DNA為模板，獲得了1條長度為1395bp的特異條帶。將序列提交到GenBank獲得登陸號為KC108656。通過Blast程序與核酸序列庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)AR66與多株腸膜明串珠菌的相似性都超過99%。將明串珠菌屬13個種的eztaxon網(wǎng)站的16S rRNA序列，與菌株AR66進(jìn)行聚類分析（圖2），菌株AR66與Leuconostoc mesenteroides的3個亞種在同一分支上，與菌株Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293的相似性達(dá)到99.713%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，可以確定菌株AR66屬于明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）。圖2中分枝上的數(shù)值為自舉（No.of Bootstrap Replicaion）1000次的結(jié)果，括號內(nèi)為16S rDNA的登陸號。

圖2　菌株AR66和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain AR66 and the reference strains

2.5乳酸菌AR66的益生活性測定

2.5.1對羥自由基清除活性的測定由圖3可以看出，當(dāng)細(xì)胞濃度在1.0×108～5.0×108CFU/mL范圍內(nèi)，菌株AR66未破碎細(xì)胞和已破碎細(xì)胞對羥自由基的清除率的總體趨勢與菌濃度均呈正相關(guān)。不同細(xì)胞濃度時，未破碎細(xì)胞對羥自由基的清除率均稍高于已破碎細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞濃度為5.0×108CFU/mL時，未破碎細(xì)胞的清除率為49.76%，高于已破碎細(xì)胞的清除率44.22%。

圖3　乳酸菌對羥自由基自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effects of LAB on hydroxyl radical

2.5.2對DPPH自由基清除活性的測定由圖4可以看出菌株AR66未破碎細(xì)胞和已破碎細(xì)胞對DPPH自由基的清除率的總體趨勢與菌體濃度均呈正相關(guān)。不同于菌株對羥自由基的清除，已破碎細(xì)胞對DPPH自由基的清除率在各個濃度下，都高于未破碎細(xì)胞的清除率。當(dāng)細(xì)胞濃度為5.0×108CFU/mL時，未破碎細(xì)胞的清除率為66.68%，已破碎細(xì)胞的清除率則達(dá)到了77.09%。

圖4　乳酸菌對DPPH自由基的清除作用Fig.4　Scavenging effects of LAB on DPPH·

2.5.3對超氧陰離子清除活性的測定由圖5可以看出，菌株AR66未破碎細(xì)胞對超氧陰離子的清除率大于已破碎細(xì)胞的清除率。未破碎細(xì)胞和已破碎細(xì)胞對超氧陰離子的清除率的總體趨勢與菌液體積菌均呈正相關(guān)。與菌株對羥自由基的清除一樣，未破碎細(xì)胞對超氧陰離子的清除率在各個濃度下，都遠(yuǎn)高于已破碎細(xì)胞的清除率。當(dāng)細(xì)胞濃度為5.0×108CFU/mL時，未破碎細(xì)胞的清除率達(dá)到了83.33%，已破碎細(xì)胞的清除率則僅為59.19%。

2.5.4降膽固醇活性的測定膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，測出的吸光值（y）與膽固醇含量（x）成正比關(guān)系，用此種方法測定菌液中膽固醇含量是切實(shí)可行的。菌株AR66對膽固醇的降解率隨著時間的增加而逐漸增大（見圖7）；48h后，降解率增長趨勢開始平緩；在60h時，對膽固醇的降解率達(dá)最大值為44.73%。

圖5　乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5　Scavenging effects of LAB on superoxide radical

圖6　膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of cholesterol

圖7　培養(yǎng)時間對乳酸菌降膽固醇的影響Fig.7　The effect of time on cholesterol-lowering ratio of LAB during growth

3　結(jié)論與討論

乳酸菌在自然界分布廣泛，實(shí)驗(yàn)從鮮牛奶中初步分離得到H2O2酶陰性、革蘭氏陽性、發(fā)酵液產(chǎn)乳酸的乳酸菌10株，對生長較好的菌株AR66進(jìn)行深入的研究。根據(jù)菌落、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性、以及16S RrDNA序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析，可鑒定菌株AR66為腸膜明串珠菌。

經(jīng)過抗氧化測定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌AR66對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，其細(xì)胞濃度與自由基的清除率呈正相關(guān)。其中未破碎細(xì)胞對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率高于已破碎細(xì)胞的清除率，在細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時，菌株AR66對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別是49.76%和83.33%；而菌株AR66未破碎細(xì)胞對DPPH自由基的清除率低于已破碎細(xì)胞的清除率，在細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時，菌株AR66已破碎細(xì)胞的清除率最高，達(dá)到77.09%。菌株AR66經(jīng)體外降膽固醇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有降解培養(yǎng)基中膽固醇的能力，降解率隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，菌株在48h后對膽固醇的降解率增加趨緩；在60h時，菌株對膽固醇降解率是44.73%。

乳酸菌的抗氧化能力與菌體表面的某些成分及細(xì)胞本身抗氧化機(jī)制有關(guān)[15]。目前報道的相關(guān)乳酸菌種類主要集中在乳桿菌屬，如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等[14-15]。而對明串珠菌屬的抗氧化、降膽固醇能力的研究很少，本實(shí)驗(yàn)篩選出的1株明串珠菌，并對其清除自由基、去除膽固醇的能力進(jìn)行了研究，這樣就可以充分利用乳酸菌開發(fā)出功能性發(fā)酵食品、提高發(fā)酵食品的附加值。

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Antioxidative and cholesterol-reducing properties of Leuconostoc mesenteroides from milk

MA Ying1，ZI Zhan-chao1，LIU Chang-jian2，*
（1.Chinese Animal Disease Prevention and Control Center，Beijing 102618，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

Using MRS media，one strain of lactic acid bacteria was isolated from milk.The strain could present Gram-positive，catalase-negative，non-spore，and produce lactic acid.The 16S rDNA gene similarities（99.7%）between strain AR66 and its closest phylogenetic neighbor，Leuconostoc mesenteroides，were higher than those previously reported within the leuconostoc.So strain AR66 was identified as L.mesenteroides.Strain AR66 had the free radical-scavenging ability.Three free radicals-scavenging ratios of strain AR66 were positively correlated with bacterial density，respectively.At a concentration of 5×108CFU/mL，the scavenging ratios of intact cells on hydroxyl radical and superoxide radical were 49.76%，and 83.33%respectively，which demonstrated obvious higher than intracellular extract.However，at the same concentration，intracellular extract had better DPPH-scavenging effect（scavenging ratios 77.09%）than the intact cells.In addition，strain AR66 for 60h had the ability of cholesterol-reducing（removal rate，44.73%）.The study had important meaning to the exploitation of probiotic health.

milk；Leuconostoc；16S rDNA；phylogenetic tree；antioxidative effect

TS201.3

A

1002-0306（2015）04-0154-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.025

2014－04－28

馬英（1963-），女，本科學(xué)士，工程師，研究方向：分子生物學(xué)。

劉長建（1975-），男，碩士，高工，研究方向：應(yīng)用微生物。

國家自然科學(xué)基金項目（31070005）。