熱-超聲波聯(lián)合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果研究

施紅英，張靜巖，吳衛(wèi)東，陳　晨，廖紅梅，丁占生

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

熱-超聲波聯(lián)合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果研究

施紅英，張靜巖，吳衛(wèi)東，陳晨，廖紅梅*，丁占生

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

研究了32～52℃條件下，熱處理以及熱-超聲波聯(lián)合處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果，分析了溫度對熱-超聲波聯(lián)合殺菌效果的影響。結(jié)果表明：32～52℃熱處理殺菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；而熱-超聲波聯(lián)合作用殺菌效果顯著增強(qiáng)，在52℃下，190、380、570W分別處理40、30min和30min即可達(dá)到平板菌落計數(shù)法檢測限；在熱-超聲波聯(lián)合處理中，較低溫度（32～47℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻(xiàn)較小，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現(xiàn)協(xié)同殺菌效應(yīng)，增強(qiáng)殺菌效果，提高殺菌速率。

鼠傷寒沙門氏菌，熱-超聲波聯(lián)合，殺菌，溫度

超聲波技術(shù)在食品工業(yè)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，例如殺菌、清洗、滅酶、均質(zhì)、結(jié)晶化、消泡、脫氣以及提取酚類化合物、精油等[1]。在殺菌方面，超聲波可作為一種有效的輔助殺菌方法，廣泛應(yīng)用于液態(tài)食品如果汁（包括橙汁、胡蘿卜汁、蘋果汁）、啤酒、牛奶和液蛋[2-3]；少量應(yīng)用于固態(tài)食品清洗消毒，包括萵苣、番茄和草莓[4-6]；同時該方法也成功用于廢水處理、飲用水消毒[7]。

超聲波殺菌主要?dú)w因于超聲過程中由于空化泡破裂產(chǎn)生瞬間高溫、高壓、剪切力以及自由基的聲化學(xué)效應(yīng)[8]。單獨(dú)采用超聲波殺菌效果有限，通?？紤]結(jié)合其他技術(shù)聯(lián)合殺菌。熱-超聲波聯(lián)合殺菌已被證實(shí)具有較好的殺菌效果。例如Salleh-Mack和Roberts報道采用低溫條件下（30°C）超聲波處理大腸桿菌（E.coli ATCC 25922）9～11min可以使其降低4～5.4個對數(shù)，而升高溫度（60°C）僅處理3min即可達(dá)到降低5個對數(shù)[9]。Ordonez[10]、方祥等[11]也報道熱-超聲波聯(lián)合處理比單獨(dú)采用相同溫度熱處理的的殺菌效果更好，目前未見有報到分析熱-超聲波聯(lián)合處理對殺菌效果的影響。

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種食品中常見致病菌，在肉、奶、蛋及其制品中比較常見，在果蔬及其制品中也容易感染從而引發(fā)腹瀉等不良癥狀。本文主要研究熱-聯(lián)合超聲波對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果，分析溫度對熱-聯(lián)合超聲波殺菌的影響，為該技術(shù)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌購自中國普通微生物菌種保藏中心（China Microbiological Culture Collection Center，CMCC），編號為CMCC 50115；牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、氯化鈉、瓊脂粉均購自北京奧博星生物科技有限公司；牛肉膏蛋白胨酵母抽提物固體培養(yǎng)基（beef peptone yeast broth，BPY）配方牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂粉15.0g/L，調(diào)pH7.0。

Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝生物技術(shù)有限公司；DC0506型低溫恒溫槽上海衡平儀器儀表廠；SW-CJ-2FD型無菌操作臺蘇州凈化設(shè)備技術(shù)有限公司；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SPX型智能生化培養(yǎng)箱南京實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1微生物培養(yǎng)根據(jù)CMCC指導(dǎo)書將鼠傷寒沙門氏菌的凍干菌粉經(jīng)過BPY液體培養(yǎng)基活化兩次以后活力得到復(fù)壯，并接種在BPY斜面培養(yǎng)基上2℃保藏。用接種環(huán)接種3環(huán)到100mL培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)。采用比濁法測定鼠傷寒沙門氏菌的生長曲線，確定其達(dá)到穩(wěn)定生長初期所需時間為10h，以得到菌活力較強(qiáng)且穩(wěn)定的菌液。培養(yǎng)好的菌液用BPY培養(yǎng)基稀釋到107CFU/mL，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌液樣品。

1.2.2熱-超聲波聯(lián)合處理將與低溫恒溫槽連接的夾套燒杯用75%酒精浸泡30min，然后用無菌去離子水沖洗3遍，再用菌液潤洗1次，加入60mL菌液，開啟水浴循環(huán)使菌液預(yù)熱到設(shè)定溫度，啟動超聲波（超聲頻率為20～25kHz），在不同溫度、功率下進(jìn)行熱-超聲波聯(lián)合處理40min，每間隔5min取樣，迅速于4℃下冷卻，并立即測定殘存菌數(shù)。同時做熱處理對照，即在不開啟超聲波的條件下，采用與熱-超聲波處理一致的溫度、時間、加樣量條件處理菌液，并取樣以測定殘存菌數(shù)。

1.2.3微生物數(shù)量測定采用平板計數(shù)法測定微生物數(shù)目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行逐級稀釋，根據(jù)細(xì)菌數(shù)量選擇合適的稀釋度進(jìn)行逐級稀釋，吸取連續(xù)3個不同稀釋度的稀釋樣1.0mL于滅菌平皿中，倒入約15mL BPY瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后在（37±0.1）℃條件下培養(yǎng)24h。并記錄菌落數(shù)。殺菌效果采用殘活率對數(shù)值（logN/N0）表示，其中：N0為處理前的初始微生物數(shù)量（CFU/mL）；N為處理后的微生物數(shù)量（CFU/mL）。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA）。數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進(jìn)行統(tǒng)計并繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1熱處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果分析

如圖1所示，32～42℃熱處理40min后，BPY培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌均存在一定程度增殖現(xiàn)象，最高達(dá)到增加0.7個對數(shù)；47℃熱處理后，鼠傷寒沙門氏菌的殘存數(shù)量基本保持不變（p＞0.05）；52℃熱處理15min之內(nèi)，鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量有所降低，但變化不顯著（p＞0.05），而處理20～40min后，其殘存菌數(shù)顯著下降（p＜0.05）。在52℃熱處理40min之后，鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量降低1.2個對數(shù)。表明單獨(dú)采用熱處理鼠傷寒沙門氏菌，其熱致死溫度大于47℃，且處理時間較長。

圖1　32～52℃下熱處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.1　Effect of mild heat on inactivation of Salmonella typhimurium at 32～52℃

2.2熱-超聲波聯(lián)合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果分析

如圖2所示，為熱-超聲波聯(lián)合處理在190W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。在32～52℃條件下，經(jīng)過熱-超聲波聯(lián)合處理后鼠傷寒沙門氏菌殘存菌數(shù)呈現(xiàn)不同程度降低，較相同溫度熱處理（圖1）其殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）；且殺菌效果隨著處理時間延長而增強(qiáng)，在52℃條件處理40min達(dá)到完全滅菌，微生物數(shù)量降低了7.88個對數(shù)；在32～47℃，殺菌效果隨溫度升高有所增強(qiáng)，但并未顯著增強(qiáng)（p＞0.05）經(jīng)過各溫度的熱-超聲波聯(lián)合處理40min后，鼠傷寒沙門氏菌降低了2.93～3.67個對數(shù)；而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到52℃，殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）；殺菌曲線呈現(xiàn)線性趨勢。

如圖3所示，為熱-超聲波聯(lián)合處理在380W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。由圖3可以得出，在各溫度條件下，殺菌效果隨著處理時間延長而增強(qiáng)；當(dāng)溫度由32℃升高到37～47℃，殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）；溫度在37～47℃之間，殺菌效果無顯著變化（p＞0.05），處理40min后鼠傷寒沙門氏菌降低了4.29～4.58個對數(shù)；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到52℃，殺菌效果劇烈而顯著增強(qiáng)，在380W下，處理15min即達(dá)到降低6個對數(shù)，處理30min即達(dá)到完全滅菌。另外，在較低溫度條件下（32～47℃），殺菌曲線呈線性趨勢，而在較高溫度下（52℃），呈現(xiàn)5min殺菌緩慢、5～20min快速殺菌、20～40min趨于平緩及至完全滅菌的三段式趨勢。由此可見，在380W條件下，溫度為37～47℃對殺菌效果影響不大，而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到52℃，則在較高溫度下改變了鼠傷寒沙門氏菌的殺菌模式。

圖3　在380W條件下低溫輔助超聲波（32～52℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.3　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 380W and 32～52℃

如圖4所示，為熱-超聲波聯(lián)合處理在570W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。由圖4可以得出，在各溫度條件下，殺菌效果隨著處理時間延長而增強(qiáng)。在32～52℃范圍內(nèi)，殺菌效果變化趨勢與380W條件下類似，即從32℃升高到37～47℃，殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）；而37～47℃之間沒有顯著變化（p＞0.05）；再次升高到52℃后殺菌效果劇烈而顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。各溫度條件下，殺菌曲線趨勢也與380W條件下類似，即32～47℃呈現(xiàn)線性下降、52℃呈現(xiàn)慢-快-慢的三段式殺菌趨勢。在37～47℃條件下處理40min，鼠傷寒沙門氏菌降低了4.35～4.72個對數(shù)，在52℃條件處理20min，使鼠傷寒沙門氏菌降低了7個對數(shù)以上。

圖4　在570W條件下低溫輔助超聲波（32～52℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.4　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 570W and 32～52℃

由圖2～圖4可以得出，在32℃條件下，殺菌效果并未隨功率增強(qiáng)而增強(qiáng)。當(dāng)溫度在37～47℃范圍，在190W條件下，隨著溫度升高，殺菌效果有所增強(qiáng)，但變化并不顯著（p＞0.05），在380～570W條件下，溫度對殺菌效果幾乎沒有影響，殺菌曲線大多聚集在一起。在52℃下，當(dāng)功率由190W增強(qiáng)為380W，殺菌效果顯著增強(qiáng)，殺菌速率增大；當(dāng)功率進(jìn)一步增強(qiáng)為570W時，殺菌效果變化并不顯著，即功率對其影響不大。

3　討論

在32～42℃條件下，熱處理對鼠傷寒沙門氏菌具有增殖影響；在52℃條件下殘存鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量才有明顯降低。在對應(yīng)相同溫度下，熱-超聲波聯(lián)合處理殺菌效果具有顯著優(yōu)勢（圖1～圖4）。說明在熱-超聲波聯(lián)合處理中熱和超聲波具有協(xié)同殺菌效應(yīng)。但在32～47℃條件下，熱效應(yīng)對聯(lián)合殺菌的影響較小，超聲波的作用占主導(dǎo)地位。在52℃條件下，二者的協(xié)同效應(yīng)顯著增強(qiáng)。熱處理協(xié)同促進(jìn)超聲波殺菌效果增強(qiáng)的現(xiàn)象在研究大腸桿菌殺菌時已被證實(shí)[9，12]。Salleh-Mack和Roberts報道在30℃條件下使大腸桿菌ATCC 25922降低4～5.4個對數(shù)需要9～11min，而結(jié)合熱處理在60℃條件下僅需處理3min就可達(dá)到降低5個對數(shù)以上[9]。說明熱-超聲波聯(lián)合殺菌在食品加工過程中具有巨大潛力。

溫度對熱-超聲波聯(lián)合處理殺菌效果影響比較復(fù)雜。由圖1可知，在營養(yǎng)豐富的BPY培養(yǎng)基中，32～42℃是鼠傷寒沙門氏菌的增殖溫度，47℃為其亞致死溫度，52℃為其致死溫度。進(jìn)而由圖2～圖4可知，在聯(lián)合超聲波處理的情況下，亞致死及增殖溫度（32～47℃）對熱-超聲波聯(lián)合處理鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻(xiàn)不大，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現(xiàn)協(xié)同殺菌效應(yīng)，增大殺菌速率。Ugarte-Romero等[13]曾報道超聲波增強(qiáng)致死溫度（50℃）對李斯特氏菌的殺菌效果。這主要是由于中等強(qiáng)度溫度的熱處理會破壞革蘭氏陰性細(xì)菌外層的細(xì)胞外膜，從而有利于超聲波作用[14]。

4　結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)可知，32～52℃熱處理殺菌效果很不理想，而熱-超聲波聯(lián)合作用殺菌效果顯著增強(qiáng)。在52℃條件下，190、380和570W分別處理40、30和30min即可達(dá)到平板菌落計數(shù)法檢測限。在熱-超聲波聯(lián)合處理中，增殖及亞致死溫度（32～47℃）對熱-超聲波聯(lián)合處理鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻(xiàn)不大，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現(xiàn)協(xié)同殺菌效應(yīng)，增大殺菌速率。

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Study on effect of temperature on inactivation of Salmonella typhimurium by thermosonication

SHI Hong-ying，ZHANG Jing-yan，WU Wei-dong，CHEN Chen，LIAO Hong-mei*，DING Zhan-sheng
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Inactivation of Salmonella typhimurium by mild heat and thermosonication at 32～52℃，especially the effect of temperature on inactivation were investigated.Results showed that it did not meet safety standards as suspension exposed to mild heat at 32～52℃，while the log-reduction of S.typhimurium was significantly enhanced by thermosonication at the same temperature.The inactivation of S.typhimurium reaching the level of non-detectable limit were achieved when suspension were under 190W for 40min and under 380，570W for 30min at 52℃，respectively.Mild heat exerted minimal inactivation effects on S.typhimurium during thermosonication treatment at lower temperature（32～47℃），and ultrasound was dominant.At lethal temperature of 52℃，the synergistic effects of ultrasound and mild heat existed，which enhanced inactivation efficacy and rates.

Salmonella typhimurium；thermosonication；inactivation；temperature

TS255.44

A

1002-0306（2015）04-0089-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.010

2014－05－23

施紅英（1991-），女，本科，主要從事食品非熱加工技術(shù)方面的研究。

廖紅梅（1983-），女，博士，講師，主要從事食品非熱加工技術(shù)方面的研究。

國家自然科學(xué)基金項目（31101360）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金資助（JUSRP21125）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。