籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水及持油性研究

鄧芝串 張 暉 張 超 王 立 錢海峰 齊希光

（江南大學食品學院1，無錫 214122）

（北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心2，北京 100097）

籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水及持油性研究

鄧芝串1張 暉1張 超2王 立1錢海峰1齊希光1

（江南大學食品學院1，無錫 214122）

（北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心2，北京 100097）

以籽瓜種子為原料，采用堿溶酸沉法提取籽瓜種子蛋白質(zhì)。測定并比較籽瓜種子蛋白和大豆?jié)饪s蛋白的持水及持油性。探究蛋白質(zhì)、氨基酸組成及含量、表面疏水性及蛋白質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)與持水及持油性的關(guān)系。結(jié)果表明：籽瓜種子蛋白的持油性是大豆?jié)饪s蛋白的1.1～1.2倍，持水性較差，僅是大豆?jié)饪s蛋白的0.65～0.7倍；籽瓜種子蛋白以球蛋白和難溶蛋白為主，分別占總蛋白的58.79%和24.15%，球蛋白對持油性不利，難溶蛋白則能增強持油性；籽瓜種子蛋白具有較高的表面疏水性，其疏水指數(shù)為440，大豆?jié)饪s蛋白較低為354，較高的表面疏水性能有益于持油性，降低持水性；結(jié)構(gòu)疏松、存在空洞縫隙的海綿狀蛋白結(jié)構(gòu)對持水性和持油性有利。

籽瓜種子 蛋白質(zhì) 持水性 持油性 結(jié)構(gòu)特性 理化特性

籽瓜又稱“打瓜”，外形與西瓜相似但比西瓜略小，屬葫蘆科普通西瓜亞種的變種，我國籽瓜主要產(chǎn)區(qū)為吉林、山西、內(nèi)蒙古等地，年產(chǎn)量為百萬t以上［1］。籽瓜種子中蛋白質(zhì)含量為36%～40%，蛋白質(zhì)含有豐富的必需氨基酸，除賴氨酸外，其他必需氨基酸均達到或超過FAO規(guī)定的標準［2－3］，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，在食品加工領(lǐng)域有著廣闊的前景。蛋白質(zhì)的持水及持油性是蛋糕、肉制品、面包、冰激凌等食品加工過程重要的特性和質(zhì)量控制指標［4］，對于風味食品來說，蛋白質(zhì)持油性可以提高食品對脂肪的吸收與持留能力，改善食品的適口性及風味［5］。目前對籽瓜種子蛋白質(zhì)的研究較少，張玉秀等［2］對其氨基酸組成進行了系統(tǒng)的評價和比較；張超等［6］優(yōu)化了提取籽瓜種子蛋白質(zhì)的工藝。

本試驗通過堿溶酸沉法提取籽瓜種子蛋白質(zhì)，測定并對比了籽瓜種子蛋白質(zhì)和大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)的持水及持油性，探究并分析了蛋白質(zhì)的理化及結(jié)構(gòu)特征與蛋白質(zhì)持水及持油性的關(guān)系，為籽瓜種子蛋白質(zhì)的深入研究及其在食品加工中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

民籽一號黑籽瓜種子：甘肅省民勤縣金谷源農(nóng)業(yè)科技有限公司；福臨門一級大豆油：中糧集團；大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)：上海嬌源集團；1－苯氨基萘－8－磺酸（ANS）：Sigma標準試劑公司；分析純氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、正己烷、乙醇等：國藥集團化學試劑有限公司

1.2 儀器設(shè)備

CR21GⅢ 高速冷凍離心機：日本日立公司；冷凍干燥機：美國Laboconcor公司 ；Delta 320 pH計：梅特勒 －托利多（上海）儀器有限公司；F－7000型熒光光譜儀：日本 HITACHI公司；Nicolet is10傅里葉變換紅外光譜儀：美國賽默飛公司；日立S－4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本日立株式會社；安捷倫1100型液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 籽瓜種子蛋白質(zhì)的提取及純度測定

籽瓜種子手動脫殼，萬能粉碎機粉碎種仁，按1∶4（W／V）比例用正己烷脫脂（溫度 50℃，時間8 h），于通風櫥中干燥8 h，再于鼓風干燥箱中50℃干燥12 h，過60目篩備用。脫脂后籽瓜種仁粉末按1∶10（W／V）料液比加入去離子水，用 0.5 mol／L的NaOH溶液調(diào)pH至11.5，61.5℃下攪拌水浴浸提77 min，3 500 r／min、25℃離心 15 min，取上清液調(diào)pH至5.0使蛋白沉淀，8 000 r／min、4℃離心15 min得蛋白沉淀，用去離子水洗滌沉淀2～3次，調(diào)pH至7.0，在－46℃、0.05 Mbar下冷凍干燥24 h得籽瓜種子蛋白質(zhì)［6］，粗蛋白含量按 GB／T 5009.5—2010測定。

1.3.2 籽瓜種子蛋白質(zhì)持油性的測定

依據(jù)文獻［7］的方法，并做適當改動：取0.5 g蛋白樣品與6 mL大豆油混勻，靜置30 min，3 000 r／min室溫離心25 min，移除上清液，沉淀稱重，按式（1）計算持油性。

1.3.3 籽瓜種子蛋白質(zhì)持水性的測定

依據(jù)文獻［8］的方法，并做適當改動：取3 g蛋白樣品與25 mL的去離子水混合，每隔10 min攪拌1次，每次1 min，共6次。后于3 000 r／min室溫離心25 min，移除上清液，沉淀于50℃干燥25 min稱重，按式（2）計算持水性。

1.3.4 蛋白質(zhì)氨基酸組成及含量的測定

稱取一定量的蛋白樣品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol／L的HCl溶液，抽真空至7 Pa后封口。將水解管置于110℃恒溫烘箱內(nèi)水解24 h后冷卻，混勻，開管，過濾，吸取適量濾液，60℃抽真空蒸干，加入3～5 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液，搖勻，離心，取上清液，以外標法于安捷倫AG1100型氨基酸專用液相色譜儀定量測定［9］。具體色譜條件：色譜柱為ODSHYPERSIL；柱溫40℃；流動相A：稱取8.0 g乙酸鈉，加入1 000 mL水攪拌溶解，再加入225 μL三乙胺，用5%的醋酸調(diào)pH至7.20，加入5 mL四氫呋喃，混合后備用；流動相B：稱取12.0 g乙酸鈉，加入400 mL水攪拌溶解，用5%醋酸調(diào)pH至7.20，加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后備用；紫外檢測器：338 nm、262 nm。洗脫條件如表1所示。

表1 氨基酸測定梯度洗脫表

1.3.5 蛋白質(zhì)組分分析

通過Osboren［10］法測定籽瓜種子蛋白質(zhì)中各組分的含量：取一定量脫脂籽瓜種子粉末，按1∶10（W／V）加入去離子水，室溫攪拌浸提60 min后于3 500 r／min離心20 min，取上清液測定清蛋白含量。所得沉淀加入5%NaCl溶液攪勻，室溫攪拌浸提60 min后于3 500 r／min離心20 min，取上清液測定球蛋白含量。所得沉淀加入75%乙醇混勻，室溫浸提60 min后于3 500 r／min離心20 min，取上清液測定醇溶蛋白含量。所得沉淀加入0.2%NaOH溶液混勻，室溫浸提60 min后于3 500 r／min離心20 min，取上清液測定谷蛋白含量。所得沉淀測定其蛋白含量，為難溶性蛋白質(zhì)［11］。

1.3.6 蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

依據(jù)Paulson等［12］使用的ANS法：用1－苯氨基萘－8－磺酸（ANS）作為熒光探針。用pH 7的磷酸鹽緩沖液，配制一系列濃度的蛋白質(zhì)溶液，濃度范圍0.000 5～0.015 mg／mL。取2 mL不同濃度的蛋白溶液加入10μL的 ANS溶液（8.0 mmol／L，pH 7的磷酸鹽緩沖液配制），立即采用F－7000型熒光光譜儀在390 nm的激發(fā)波長（狹縫1 nm）和470 nm的發(fā)射波長下，以未加ANS溶液的蛋白溶液做空白，測定樣品的熒光強度FI。以熒光強度對蛋白濃度做曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水活性S0。

1.3.7 蛋白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)分析

取少量凍干的蛋白質(zhì)樣品，用1%的四氧化鋨固定1 h，經(jīng)過離子濺射儀噴金處理后，置于日立S－4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡下，放大2 000×和10 000×的條件下進行觀察、拍照，分析蛋白質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所涉及到的測定結(jié)果均做3次平行，試驗數(shù)據(jù)用Origin 8.6進行處理，用SPSS軟件進行顯著性分析處理。

2 結(jié)果及討論

2.1 籽瓜種子蛋白質(zhì)的含量

由表2可知，堿溶酸沉法制得的籽瓜種子蛋白冷凍干燥后，含量與市售大豆?jié)饪s蛋白相似，大豆?jié)饪s蛋白作為食品中常用蛋白添加劑具有良好的功能性質(zhì)，在工業(yè)上應用廣泛。本試驗以市售大豆?jié)饪s蛋白作對比，目的是更好地了解籽瓜種子蛋白的持水及持油性，為其應用提供理論基礎(chǔ)。

表2 籽瓜種子蛋白質(zhì)的純度

2.2 籽瓜種子蛋白質(zhì)的持油性

由圖1和圖2可知，籽瓜種子蛋白的持油性明顯比大豆?jié)饪s蛋白好，是大豆?jié)饪s蛋白的1.1～1.2倍。由圖1可知，蛋白質(zhì)的持油性隨溫度的升高先增加后降低，籽瓜種子蛋白和大豆蛋白的持油性均在30℃的時候達到最大值，分別為172.12 g／100 g、156.09 g／100 g，這是因為隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不斷伸展打開，部分疏水基團暴露，蛋白質(zhì)的持油性增加。當溫度超過30℃時，油的流動性增加，導致持油性降低［13］。由圖2可知，蛋白質(zhì)的持油性隨著維持時間的增加先升高后保持穩(wěn)定。因為當時間達到50～60 min時，籽瓜種子蛋白和大豆?jié)饪s蛋白因為不同的理化與結(jié)構(gòu)特性導致蛋白質(zhì)的持油性均達到了不同的飽和狀態(tài)，分別為177.5 g／100 g、157.63 g／100 g，當時間繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)的持油性不再增加［14］。

圖1 溫度對持油性的影響

圖2 持油時間對持油性的影響

2.3 籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水性

由圖3～圖5可知，籽瓜種子蛋白的持水性明顯低于大豆?jié)饪s蛋白，僅是大豆?jié)饪s蛋白的0.65～0.7倍。由圖3可知在30～80℃范圍內(nèi)，持水性隨著溫度的升高而增加，這是因為適當?shù)纳郎厥沟鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)伸展、膨松，蛋白質(zhì)與水分子間作用力增大，提高了蛋白的持水性。當溫度達到80℃時，籽瓜種子蛋白和大豆?jié)饪s蛋白的持水性達到最大值，分別為384.62 g／100 g、792.72 g／100 g。但當溫度超過 80℃時，蛋白質(zhì)變性發(fā)生聚集、大量的疏水基團暴露，使蛋白的持水性下降［14－15］。圖4可知NaCl濃度對2種蛋白的持水性影響均不大。由圖5可知，pH對蛋白持水性的影響較大，在等電點附近籽瓜種子蛋白和大豆?jié)饪s蛋白的持水性最低分別為322.32 g／100 g、511.89 g／100 g，但當 pH大于 7時，蛋白質(zhì)的持水性隨pH的增加而降低，大豆?jié)饪s蛋白的持水性由pH為7時的546.3 g／100 g減少為pH為9時的488.29 g／100 g，而籽瓜種子蛋白的持水性由pH為7時的377.14 g／100 g減少為pH為9時的355.1 g／100 g，這是由于pH升高，改變了蛋白質(zhì)的帶電荷數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度增加，從而導致實測的持水性下降［16］。

圖3 溫度對持水性的影響

圖4 NaCl濃度對持水性的影響

圖5 pH對持水性的影響

2.4 籽瓜種子蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量

表3中K－D法：氨基酸殘基的疏水參數(shù)是Kyte等［17］同時考慮氨基酸在有機溶劑和水中的分配系數(shù)，以及氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的分布2個方面總結(jié)而成，負值越大，疏水性越差，親水性越強。理論上，組成蛋白質(zhì)的氨基酸中殘疏水性氨基酸殘基含量越多，蛋白質(zhì)持油性好的可能越大。由表3可知：從氨基酸的組成和含量上看，2種蛋白質(zhì)中疏水性強的非極性氨基酸異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸的含量和親水性強的氨基酸含量并無明顯差異，相反，從非極性氨基酸殘基與強極性氨基酸的比例來講，籽瓜種子蛋白質(zhì)的為35.5%，大豆蛋白質(zhì)的為39.9%。但極性與非極性氨基酸在蛋白質(zhì)表面的分布，卻有明顯差異，籽瓜種子蛋白質(zhì)中，更多的非極性氨基酸分布在其表面形成疏水基團［18］，使該蛋白質(zhì)對游離脂的親和力加強，對水的親和力減弱，而大豆蛋白則與之相反。

表3 籽瓜種子蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量

2.5 籽瓜種子蛋白質(zhì)組成

由表4可知，籽瓜種子蛋白中球蛋白的含量相對較低，為58.79%，大豆?jié)饪s蛋白中球蛋白的含量則較高，為65.53%。在球蛋白中，由于疏水相互作用，疏水基團相互靠攏并趨于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，親水基團則多分布于球蛋白表面，從此方面來說球蛋白含量越多，對蛋白質(zhì)的持油性越不利，對持水性越有利。同時，籽瓜種子蛋白中清蛋白的含量也較低，為10.64%，清蛋白是一種可溶性蛋白，親水性強，容易持留更多的水，所以清蛋白含量越多越不利于蛋白質(zhì)的持油性，而對蛋白質(zhì)的持水性有利。籽瓜種子蛋白質(zhì)中具有24.15%的難溶性蛋白質(zhì)，難溶性蛋白質(zhì)之所以難溶是因為蛋白表面存在的大量疏水基團，可以束縛更多的脂肪烴鏈，進而增加了籽瓜種子蛋白質(zhì)對油的持留作用［19］。

表4 籽瓜種子蛋白的蛋白質(zhì)組成／%

2.6 籽瓜種子蛋白質(zhì)的表面疏水性

如圖6所示，籽瓜種子蛋白的表面疏水性比大豆?jié)饪s蛋白好，其中籽瓜種子蛋白質(zhì)的表面疏水指數(shù)為440，而大豆蛋白為354，說明在蛋白質(zhì)的表面有更多的非極性氨基酸殘基暴露，形成疏水區(qū)域［20］，使蛋白質(zhì)對水的親和力下降，對游離脂的親和力增加，有利于蛋白質(zhì)的持油性，這與Nasri［21］研究報道疏水性可以增加蛋白質(zhì)的持油性相一致。

圖6 蛋白質(zhì)的表面疏水活性

2.7 籽瓜種子蛋白質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)

由圖7和圖8可知，籽瓜種子蛋白具有較為疏松的超微結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)表面是類似蜂窩狀的片層空洞結(jié)構(gòu)，并且籽瓜種子蛋白之間相互交聯(lián)產(chǎn)生了很多疏松的縫隙和孔洞，有利于油滴和水滴的進入。由圖6可知，籽瓜種子蛋白質(zhì)空洞和縫隙的表面具有較多的疏水基團有利于蛋白質(zhì)的持油性［22］，但表面過多的疏水基團會排斥水分子的進入，使持水性降低。由圖9和圖10可知，大豆蛋白為較為松散的球狀蛋白，蛋白質(zhì)表面比較光滑，蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)很弱大豆蛋白的表面疏水較差，而較差的表面疏水性使蛋白質(zhì)與油的疏水相互作用較弱，不利于大豆蛋白質(zhì)對油的吸收及維持，反之較弱的疏水性，有利于蛋白質(zhì)與水的結(jié)合，對蛋白質(zhì)的持水性有利［23－24］。

圖7 籽瓜種子蛋白質(zhì)的掃描電鏡圖（2 000×）

圖8 籽瓜種子蛋白質(zhì)表面的掃描電鏡圖（10 000×）

圖9 大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)的掃描電鏡圖（2 000×）

圖10 大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)表面的掃描電鏡圖（10 000×）

3 結(jié)論

與大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)相比，籽瓜種子蛋白質(zhì)的持油性較好，但持水性較差。除NaCl濃度對蛋白質(zhì)的持水性影響不大之外，溫度、pH、維持時間等因素對籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水和持油性均有較大的影響。籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水性和持油性是蛋白質(zhì)多種理化、結(jié)構(gòu)特性共同作用的結(jié)果，不僅與氨基酸組成及含量有關(guān)，而且與極性和非極性氨基酸的分布有關(guān)，表面的非極性氨基酸形成的疏水基團能增加蛋白質(zhì)的持油性，而對持水性不利。籽瓜種子蛋白中含58.79%的球蛋白和24.15%的難溶蛋白，難溶蛋白能增加持油性，而球蛋白對持水性有利。籽瓜種子蛋白質(zhì)具有較高的表面疏水性，能增加蛋白質(zhì)對油的吸收及維持作用，降低蛋白質(zhì)對水的吸收。籽瓜種子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、存在大量的海綿狀空洞縫隙有利于油和水分子的進入，但進入蛋白質(zhì)的油和水分子能否被持留，仍與蛋白質(zhì)的其他理化性質(zhì)有關(guān)。

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Study on Water and Fat Absorption of Seed－watermelon's Seeds Protein

Deng Zhichuan1Zhang Hui1Zhang Chao2Wang Li1Qian Haifeng1Qi Xiguang1

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University1，Wuxi 214122）（Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences2，Beijing 100097）

Protein has been extracted from seed－watermelon's seeds by alkali extraction and acid precipitation method in the paper.The retention and fat absorption of seed－watermelon's seeds protein have been evaluated and the soybean protein concentrate were also compared.The relationship of composition，count of protein and amino acid，surface hydrophobicity，ultrastructure of proteins and the retention and fat absorption of protein were studied respectively.The results showed that the fat absorption of seed－watermelon's seeds protein could be 1.1～1.2 times of that of soybean protein concentrate，but the retention was not as well as the fat absorption，which was only 0.65～0.7 times；protein of seed－watermelon's seeds mainly included globulin and insoluble protein，which accounted for 58.79%and 24.15%of total protein respectively.The existence of globulin had a passive effect on fat absorption，while insoluble protein increased the fat absorption；protein of seed－watermelon's seeds had high surface hydrophobicity of 440，while the soybean protein concentrate was only 354.The relatively higher surface hydrophobicity increased the fat absorption while reduced the retention；the protein with a loose spongy structure was satisfied for retention and fat absorption of protein.

seed－watermelon's seed，protein，retention，fat absorption，structural characteristics，physicochemical characteristics

TQ432.2

A

1003－0174（2015）09－0049－06

863計劃（2013AA102203－07）

2014－03－31

鄧芝串，男，1990年出生，碩士，糧食與植物蛋白

張暉，女，1966年出生，教授，谷物與健康食品