郝瑞芳 景 浩
(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系1,太原 030009)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院2,北京 100083)
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郝瑞芳1景 浩2
(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系1,太原 030009)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院2,北京 100083)
運(yùn)用天冬酰胺/葡萄糖模式反應(yīng)體系研究了牛磺酸對富含淀粉的食品中丙烯酰胺生成的影響及其抑制機(jī)理。試驗(yàn)結(jié)果顯示:?;撬崮軌蝻@著抑制天冬酰胺/葡萄糖反應(yīng)體系中丙烯酰胺的生成,且抑制率與濃度呈劑量關(guān)系。運(yùn)用LC-QTOF分析得到2種主要的反應(yīng)產(chǎn)物:丙烯酰胺-?;撬峒雍衔锖捅0范垠w-?;撬峒雍衔?。此外,?;撬崤c葡萄糖共存于同一體系中加熱時(shí),葡萄糖的含量顯著下降,說明牛磺酸可與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)。通過模式反應(yīng)體系證明:牛磺酸能夠顯著降低富含淀粉食品中的丙烯酰胺含量;抑制機(jī)理主要是?;撬崤c丙烯酰胺直接發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物為丙烯酰胺-?;撬峒雍衔锖捅0范垠w-?;撬峒雍衔?,從而除去體系中已經(jīng)生成的丙烯酰胺。此外,?;撬崮軌蚺c葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng),從而與天冬酰胺競爭消耗體系中的葡萄糖,減少了食品中的丙烯酰胺含量。
?;撬?富含淀粉食品 丙烯酰胺 抑制機(jī)理
2002年瑞典國家食品局和斯德哥爾摩大學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)長時(shí)間油炸的食品(如炸薯?xiàng)l和谷物)中含有一定量的丙烯酰胺(Acrylamide,AA)。AA是一種具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性的物質(zhì),已被國際癌癥研究總署列為“人類可能的致癌物”(2A類)[1]。AA的形成主要是食品中的氨基酸(主要是天冬酰胺,Asparagine,Asn)和還原糖(如葡萄糖,Glucose,Glc;果糖,F(xiàn)ructose,F(xiàn)ru)在 120℃以上的高溫油炸或焙烤條件下,通過美拉德反應(yīng)而生成,且隨著加熱溫度的升高,AA的生成明顯增加[2-3]。多數(shù)食品因含一定量的氨基酸、蛋白質(zhì)和糖,在加熱過程發(fā)生美拉德反應(yīng)。
研究表明在模擬體系和谷物、馬鈴薯等食品體系中添加甘氨酸、賴氨酸和半胱氨酸能夠有效地抑制 AA的生成[4-6]。?;撬幔═aurine,Tau)是一種含硫氨基酸,是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)含量最豐富的自由氨基酸,廣泛存在于所有動(dòng)物的組織、細(xì)胞內(nèi),特別是神經(jīng)、肌肉和腺體中的含量較高,以海洋生物中含量為最高[7]。?;撬崮軌騾⑴c美拉德反應(yīng),有研究表明牛磺酸能通過競爭性消耗葡萄糖來抑制白蛋白的糖基化反應(yīng)。
本試驗(yàn)以天冬酰胺/葡萄糖(Asn/Glc)體系為模型,利用高效液相色譜法研究?;撬釋κ称敷w系中AA的生成是否有抑制作用,進(jìn)一步利用液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜法證實(shí)了其抑制機(jī)理。
SPD-20A型高效液相色譜儀:日本Shimadzu公司,配紫外檢測器;Thermo Hypersil ODSC18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5μm):美國 Thermo公司;Agilent 1200型液相色譜儀:美國 Agilent公司;Qstar Elite四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀:美國Applied Biosystems公司;Sunfire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm):美國Waters公司。
丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.5%:德國 Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司;?;撬幔簢幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
丙烯酰胺儲(chǔ)備液濃度1.0 mg/g;磷酸鹽緩沖液配制:稱取 KH2PO40.20 g,Na2HPO4·12H2O 2.90 g,KCl 0.20 g,NaCl 8.00 g,加 900 mL去離子水溶解,用18%的HCl調(diào)pH值至7.4,最后定容至1 L。
1.2.1.1 Asn/Glc/Tau反應(yīng)體系
準(zhǔn)確稱取 Asn 0.15 g,Glc 0.20 g,稱取4份,1份做為對照組,其余3份中分別加入100 mg/g的Tau 100、500、1 000μL,分別置于 4個(gè) 10 mL的容量瓶中,用PBS(pH 7.4)溶解,調(diào)溶液pH為8.0,定容至10 mL,使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L,Tau的終濃度分別為1、5、10 mg/g。
1.2.1.2 Tau/Glc反應(yīng)體系
準(zhǔn)確稱取 Tau 0.10 g,Glc 0.20 g,置于10 mL的容量瓶中,用PBS(pH 7.4)溶解,調(diào)溶液pH為8.0,最后定容至10 mL,終濃度分別為 Tau 10 mg/g,Glc 0.1 mol/L。
1.2.1.3 AA/Tau反應(yīng)體系
準(zhǔn)確稱取AA 1.0 mg,Tau 0.10 g,置于10 mL的容量瓶中,用PBS(pH 7.4)溶解,調(diào)溶液pH為8.0,最后定容至10 mL,終濃度分別為 AA 100μg/g,Tau 10 mg/g。
將配好的上述反應(yīng)體系分別加入耐高壓玻璃管中,將耐高壓玻璃管密閉并置于油浴鍋中,分別于150℃下加熱0~60 min,反應(yīng)體系的溫度用紅外測溫儀測量。反應(yīng)結(jié)束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應(yīng)。
采用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)測定反應(yīng)體系中的AA含量,操作條件為:色譜柱Thermo Hypersil ODS C18(250 mm × 4.6 mm,5μm),保護(hù)柱 C18(13 mm ×4.0 mm,5μm),流動(dòng)相甲醇∶水 =3∶97,等濃度洗脫,流速 0.7 mL/min,柱溫為室溫(25℃),進(jìn)樣量20μL,紫外檢測器,波長204 nm。
AA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:用超純水稀釋AA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,分別配制成 1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/g的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述條件進(jìn)行分析。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制AA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
對AA/Tau反應(yīng)體系中的產(chǎn)物采用液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Liquid Chromatography-QSTAR Time of Flight,LC-QTOF)得到的離子碎片進(jìn)一步確定[8]。液相條件為:Agilent 1200型液相色譜儀,Sunfire C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm,5μm),柱溫為室溫,流動(dòng)相甲醇∶水 (0.1%甲酸)=10∶90,流速 0.3 mL/min。Turbo電噴霧離子源,正離子模式,掃描的質(zhì)荷比范圍為50~600。質(zhì)譜參數(shù):離子源電壓4 200 V,霧化氣(Gas 1)50 V;輔助氣 (Gas 2)60 V;簾氣 (CUR)20 V;脫溶劑氣溫度 450℃;解簇電壓(DP)50 V;聚焦電壓(FP)380 V。監(jiān)測離子:AA-Tau加合物m/z197,m/z268。AA聚合物m/z143,m/z214。待測反應(yīng)產(chǎn)物用含0.1%甲酸水溶液稀釋10倍,過0.45 μm濾膜,進(jìn)行分析。
每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)測定3次,結(jié)果表示為Means±SD。采用 MINITAB 13.20軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析。鄧肯氏多重檢驗(yàn)用來確定數(shù)據(jù)間的差異,顯著水平為P<0.05。
首先取1.0μg/g的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液,用紫外分光光度計(jì)在190~300 nm波長范圍內(nèi)掃描,見圖1,結(jié)果顯示AA在204 nm處有最大吸收,因此選擇檢測波長為204 nm測定反應(yīng)體系中的AA含量,這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果基本一致[9-10]。
圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜掃描圖
采用甲醇和水的混合溶劑作為流動(dòng)相,篩選不同濃度甲醇和水的配比,將甲醇和水的比例從0∶100、1∶99、2∶98……,一直調(diào)到 10∶90,用 HPLCUV檢測AA的分離效果和峰形。結(jié)果顯示:當(dāng)甲醇和水的比例為3∶97時(shí),AA與反應(yīng)體系中的其他成分可以達(dá)到很好的分離,AA出峰時(shí)間為6.944 min,這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[9]。
用HPLC-UV法測定 Asn/Glc反應(yīng)體系中的AA含量。以不同濃度的AA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣,每個(gè)濃度測定3次,取平均值,以AA濃度(C)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為A=278 512C-15 148,R2=0.998(n=3)表明 AA在0~20μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
為了更好地看出AA標(biāo)準(zhǔn)品和Asn/Glc反應(yīng)體系中AA的出峰時(shí)間、峰形及各反應(yīng)時(shí)間下的AA含量,選擇橫、縱坐標(biāo)均相同的幾個(gè)加熱溫度和時(shí)間下的AA圖譜進(jìn)行比較(見圖2)。結(jié)果顯示:不同加熱溫度和加熱時(shí)間下得到的Asn/Glc反應(yīng)體系中的AA也能夠在該色譜條件下進(jìn)行很好的分離,且反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍后,產(chǎn)物中的AA濃度恰好在AA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi),因此選擇稀釋倍數(shù)為10倍。
圖2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品和天冬酰胺/葡萄糖反應(yīng)體系中生成的丙烯酰胺的色譜圖
圖3顯示了Tau對Asn/Glc反應(yīng)體系中AA生成的影響。當(dāng)添加1、5、10 mg/g的 Tau時(shí),體系中AA的生成量分別從117.7μg/g(對照組)降低至97.9、78.4、43.1μg/g,對 AA生成的抑制率分別達(dá)到16.8%、33.4%、63.4%。說明高、中、低濃度的Tau均能顯著抑制Asn/Glc體系中AA的生成。該結(jié)果與甘氨酸的的抑制率接近[11],在 Asn/Glc模式反應(yīng)體系中添加10 mg/g的甘氨酸,能使體系中AA的含量降低約60%。Shin等[12]研究表明在Asn/Glc水溶液體系中添加0.1%~2.5%的Tau,于150℃加熱30 min,Tau顯著抑制了體系中AA的生成;土豆片在油炸前預(yù)先用0.1%~2.0%的Tau浸泡30 min,結(jié)果顯示油炸后土豆片中的AA含量顯著下降。
圖3 ?;撬釋μ於0?葡萄糖反應(yīng)體系中丙烯酰胺生成的影響
利用LC-QTOF MS分析能夠進(jìn)一步確定AA/Tau反應(yīng)體系中的產(chǎn)物,且四極桿飛行時(shí)間質(zhì)量分析器能夠給出物質(zhì)的精確分子質(zhì)量。圖4給出了AA/Tau體系于150℃反應(yīng)60 min時(shí)體系中各物質(zhì)的色譜圖。反應(yīng)60 min時(shí),體系中除包含有未反應(yīng)完的AA和Tau外,新生成的物質(zhì)有AA-Tau加合物、AA二聚體-Tau加合物、AA二聚體和AA三聚體。m/z197的 [M+H]+是一分子AA(Mr=71)和一分子Tau(Mr=125)形成的 AA-Tau加合物,m/z268的[M+H]+是兩分子 AA(Mr=71)和一分子 Tau(Mr=125)形成的AA二聚體-Tau加合物,AA-Tau加合物的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AA二聚體-Tau加合物。Tau含有NH2基團(tuán),與AA的CH2=CH2不飽和雙鍵易發(fā)生麥克爾加成反應(yīng),生成的AA-Tau加合物還含有1個(gè)親核基團(tuán)(NH),可以和另一分子的AA結(jié)合形成AA二聚體-Tau加合物,該結(jié)合方式與甘氨酸和AA的結(jié)合方式類似[11,13]。m/z143的[M+H]+是兩分子 AA(Mr=71)聚合形成的 AA二聚體,m/z214的 [M+H]+是三分子 AA(Mr=71)的聚合產(chǎn)物,AA二聚體的含量高于三聚體。Stadler等[14]研究表明AA含有不飽和雙鍵,在高溫下很容易發(fā)生聚合反應(yīng),且反應(yīng)體系中有鹽的存在更容易促進(jìn)AA的聚合[15]。LC-QTOF結(jié)果表明AA-Tau加合物是生成的主要產(chǎn)物,證實(shí)了Tau能夠與AA直接發(fā)生反應(yīng),從而消除體系中的AA。
圖4 加熱60 min后丙烯酰胺/?;撬狍w系中生成物的色譜圖
Glc在單獨(dú)加熱和Tau/Glc反應(yīng)體系中的含量變化如表1所示,Glc單獨(dú)加熱時(shí),反應(yīng)15 min,Glc含量下降了11%,再延長反應(yīng)時(shí)間,Glc含量無明顯變化,可能是由于Glc在高溫下加熱時(shí)自身發(fā)生降解而使?jié)舛嚷杂邢陆?,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[10]。當(dāng)Glc與Tau共存于同一體系中加熱時(shí),Glc含量顯著下降,說明Tau與Glc發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致Glc含量下降。早有研究報(bào)道Tau和乳糖之間可以發(fā)生美拉德反應(yīng),生成褐色的產(chǎn)物[16]。而且當(dāng)把Tau加入到葡萄糖/白蛋白體系中時(shí),Tau能通過競爭性消耗葡萄糖來抑制白蛋白的糖基化反應(yīng)[17]。
表1 各反應(yīng)體系加熱(150℃)不同時(shí)間下的葡萄糖含量的變化
如圖5所示,Tau單獨(dú)加熱時(shí)含量無變化,說明Tau的熱穩(wěn)定性很好,該結(jié)果與文獻(xiàn)[18]一致。但當(dāng)Tau與Glc于同一體系中加熱時(shí),Tau的含量顯著下降,且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而顯著降低,反應(yīng)達(dá)到60 min時(shí)Tau含量降低最大,達(dá)到28%,進(jìn)一步證明了Tau與Glc一起加熱時(shí)會(huì)發(fā)生反應(yīng)。有研究結(jié)果表明將Tau與乳酸置于同一緩沖液中加熱,Tau的含量下降,體系的褐變程度增加,說明Tau能夠與乳酸發(fā)生美拉德反應(yīng)[16]。將Tau添加到葡萄糖-白蛋白的混合溶液中于37℃孵育30 d,Tau能夠與白蛋白競爭消耗葡萄糖,從而抑制白蛋白的糖基化反應(yīng)[17]。
圖5 各反應(yīng)體系加熱(150℃)不同時(shí)間下的牛磺酸含量的變化
根據(jù)上述研究結(jié)果,本試驗(yàn)提出2條Tau抑制Asn/Glc反應(yīng)體系中AA的反應(yīng)途徑(圖6)。一條是Tau通過與Asn競爭消耗Glc來減少體系中AA的生成,Tau/Glc體系發(fā)生的Maillard反應(yīng)為該途徑提供了直接的依據(jù)[19]。另一條途徑是,Tau與 AA發(fā)生Michael親核加成反應(yīng)生成AA-Tau加合物,這是反應(yīng)的主要產(chǎn)物,此外還生成極少量的AA二聚體-Tau加合物。AA還有2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(共軛雙鍵和氨基),親電雙鍵能夠與Tau的氨基發(fā)生親核加成反應(yīng),生成的產(chǎn)物AA-Tau加合物還含有1個(gè)親核基團(tuán)(NH),可以和另一分子的AA結(jié)合形成AA二聚體-Tau加合物[20]。此外,Tau的存在還促進(jìn)了AA自身發(fā)生聚合作用,該結(jié)果與NaCl的作用相似[15]。
圖6 牛磺酸抑制丙烯酰胺生成的機(jī)理
利用Asn/Glc模式反應(yīng)體系證明,添加 Tau(1、5、10 mg/g)能夠顯著抑制體系中 AA的生成,Tau為10 mg/g時(shí),抑制率最大達(dá)71.3%。抑制機(jī)理為:Tau既能夠與Glc發(fā)生美拉德反應(yīng),從而與Asn競爭消耗體系中的Glc,減少AA的生成;又能夠與AA直接發(fā)生親核加成反應(yīng),從而除去體系中已經(jīng)生成的AA,反應(yīng)產(chǎn)物為AA-Tau加合物和AA二聚體-Tau加合物,前者生成量高于后者,這是Tau降低Asn/Glc模式體系中AA含量的主要反應(yīng)途徑。同時(shí),Tau還有助于促進(jìn)AA的聚合反應(yīng),生成AA二聚體和AA三聚體,二聚體含量高于三聚體。通過模式反應(yīng)體系推測證明,?;撬崮軌蛴行У匾种聘缓矸鄣挠驼?、焙烤類食品中丙烯酰胺的含量。
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The Inhibitory Effect of Taurine on Acrylamide Rich in Starch-Enriched Food
Hao Ruifang1Jing Hao2
(Department of horticulture,Shanxi Forestry Vocational Technical College1,Taiyuan 030009)(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University2,Beijing 100083)
The inhibitory effect and mechanism of taurine(Tau)on acrylamide(AA)formation rich in starch-enriched food,by using asparagine/glucose(Asn/Glc)model system.The results showed that AA formation was effectively inhibited in Asn/Glc model system by taurine.LC-QTOFMS revealed twomain peaks in extracted ion chromatograms[M+H]+atm/z197 andm/z268 when AA was heated with Tau,which were identified as AA-Tau and AA dimmer-Tau adducts,respectively.The results also showed thatGlc contentwas effectively decreased when Glc was heated with Tau in Tau/Glcmodel system,which indicated thatGlc could react directly with Tau in themodel system.These results obtained by the above-mentioned model reaction systems demonstrated that taurine could reduce the content of acrylamide rich in starch-enriched food effectively.The inhibitory effect of Tau on AA formation was not onlymediated through reacting directly with AA to promote formation of AA-Tau and AA dimer-Tau adducts,but also reacting with Glc by Maillard reaction to contest consumption of Glc with Asn.
taurine,starch-enriched food,acrylamide,inhibitorymechanism
TS21
A
1003-0174(2015)08-0105-07
國家自然科學(xué)基金(31171676)
2014-02-14
郝瑞芳,女,1978年出生,講師,食品安全與質(zhì)量控制
景浩,男,1957年出生,教授,生物活性物質(zhì)與功能性食品