核桃蛋白有限酶解增溶改性的工藝研究

沈敏江 王文輝 劉 麗 劉紅芝 王 強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所1，興城 125100）（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，北京 100193）

核桃蛋白有限酶解增溶改性的工藝研究

沈敏江1，2王文輝1劉 麗2劉紅芝2王 強(qiáng)2

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所1，興城 125100）（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，北京 100193）

為充分利用核桃榨油后的核桃粕，研究了核桃蛋白有限酶解增溶改性的工藝，以拓寬核桃蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍，提高產(chǎn)品附加值。通過比較不同蛋白酶對核桃蛋白的水解度和氮溶指數(shù)的影響，篩選出胰蛋白酶為最佳用酶。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)對胰蛋白酶有限酶解核桃蛋白的工藝加以優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳酶解工藝條件為：液料比10∶1，酶解溫度43℃，酶解時(shí)間52 min，酶用量0.4%。最佳條件下制備的改性核桃蛋白的水解度僅為3.25%，而氮溶指數(shù)從8.74%顯著提升到78.16%。

核桃蛋白 蛋白酶 有限酶解 溶解性 工藝優(yōu)化

核桃是世界上廣泛分布的樹生堅(jiān)果，具有很高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2011年世界核桃產(chǎn)量為340萬t，其中我國占總產(chǎn)量的48.36%，居世界首位［1］。核桃仁中含有66.9%的油脂和16.33%的蛋白質(zhì)，油脂中富含的不飽和脂肪酸對人體健康尤其重要［2］。核桃蛋白中的8種必需氨基酸比例合理，其中谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，對人體生理作用具有重要的功能［3］。我國的核桃主要用于榨油，而榨油后核桃餅粕大部分用作飼料，很少用于食品加工中，附加值低。核桃粕中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)56%，核桃蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白組成，分別占總蛋白的70.11%、17.57%、6.81%、5.33%［4］。由于核桃蛋白中大部分為谷蛋白，導(dǎo)致其在水中的溶解性特別差，嚴(yán)重限制了其在食品中的應(yīng)用。因此，通過一定的技術(shù)手段來提高核桃蛋白的溶解性是十分必要的，充分利用我國豐富的核桃蛋白資源，促進(jìn)核桃榨油工業(yè)的副產(chǎn)物利用，提高產(chǎn)品附加值。

許多物理、化學(xué)、酶解等方法均能用于改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性［5－7］，其中酶解增溶改性因其條件溫和、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到了廣泛的應(yīng)用［8－10］。有限的蛋白酶水解作用能使蛋白質(zhì)大分子表面的疏水基團(tuán)降解，將包裹在分子內(nèi)部的親水基團(tuán)暴露出來，從而使蛋白質(zhì)的水溶性顯著提高［11］。但是酶種類的選擇不當(dāng)或水解度過高均會導(dǎo)致苦味的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響水解產(chǎn)物的感官品質(zhì)。因此，選擇合適的蛋白酶，控制較低的水解度，同時(shí)提高蛋白質(zhì)的溶解性成為生產(chǎn)工藝中需要解決的技術(shù)問題。

本研究以冷榨核桃粕為原料，對有限酶解所用的蛋白酶種類進(jìn)行了篩選。通過考察酶用量、底物濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間對酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化有限酶解核桃蛋白的最佳工藝，獲得高氮溶指數(shù)、低水解度、具有良好感官品質(zhì)的高水溶性核桃蛋白粉。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

冷榨核桃粕：陜西天玉公司；中性蛋白酶（6.0×104U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）：諾維信公司；復(fù)合蛋白酶（5.0×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（2.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（5.0×105U/g）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備

FDV型粉碎機(jī)：臺灣佑崎公司；FE20型pH計(jì)：瑞士梅特勒－托利多公司；KIELETEC ANALYSISER全自動凱氏定氮儀：瑞士Foss公司；LGJ－25C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選用復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在溫度40℃、酶用量0.3%、液料比10∶1和反應(yīng)時(shí)間40 min的條件下，分別測定酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)（NSI）和水解度（DH）。

1.3.2 單因素酶解試驗(yàn)

用粉碎機(jī)將冷榨核桃粕粉碎至粒度100目以上制成核桃脫脂粉，稱取10 g核桃脫脂粉分散于100 mL的去離子水中，加入0.3 g胰蛋白酶后，水浴40℃恒溫振蕩反應(yīng)40 min，待反應(yīng)結(jié)束后，90℃水浴10 min滅酶，冷卻到室溫后測定水解度。酶解產(chǎn)物凍干后于－20℃保存，用于氮溶指數(shù)的測定。改變其中一個(gè)反應(yīng)條件，固定其余條件，分別考察酶用量、液料比、反應(yīng)溫度和酶解時(shí)間對氮溶指數(shù)和水解度的影響。各因素水平梯度見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因子水平表

1.3.3 氮溶指數(shù)的測定

精確稱量2 g凍干后的酶解產(chǎn)物，分散于去離子水中，定容至50mL。室溫下振蕩2 h，于4 500 r/min的條件下離心20 min，量取5 mL上清液用凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量，氮溶指數(shù)按下式計(jì)算：

式中：NSI為酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)/%；N1為5mL上清液中的可溶性氮/mg；N2為2 g樣品中的總氮/mg。

1.3.4 水解度的測定

采用pH－Stat法測定［12］，水解度按下式計(jì)算：

式中：DH為水解度/%；B為堿液體積/mL；Nb為堿液物質(zhì)的量濃度/mol/L；α為α－氨基的解離度；MP為底物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；htot為底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)/mmol/g蛋白，本研究核桃蛋白取htot＝8.0。

1.3.5 乳化特性的測定

采用 Pearce等［13］的方法。

1.3.6 起泡特性的測定

采用 Booma等［14］的方法。

1.3.7 多因素酶解試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定液料比10∶1，選取溫度（X1），時(shí)間（X2），胰蛋白酶用量（X3）為影響因子，以氮溶指數(shù)（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)（表2），以確定最佳有限酶解工藝。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3個(gè)試驗(yàn)樣本的平均值，響應(yīng)面模型回歸方程采用SAS 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和計(jì)算，采用Design－Expert8.0.6作因子交互作用的等高線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶種類的篩選

本試驗(yàn)分別選用的5種蛋白酶在中性環(huán)境下均具有較高的酶活力。結(jié)果如圖1所示，核桃蛋白粉有限酶解后較酶解前其溶解性得到了極顯著的提高，表明酶解的方法適合于對核桃蛋白粉溶解性的改善。復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶對酶解后核桃蛋白的氮溶指數(shù)提高較顯著，分別達(dá)到了68.96%和69.96%，而水解產(chǎn)物的水解度分別為5.54%和2.26%，其中胰蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有較低的水解度。由于較高的水解度會導(dǎo)致苦味肽的形成，而高溶解性的核桃蛋白粉酶解產(chǎn)物主要用途是應(yīng)用于蛋白飲料，苦味會嚴(yán)重?fù)p害其在產(chǎn)品中的應(yīng)用。因此，綜合氮溶指數(shù)改善效果和水解度因素，選定胰蛋白酶作為核桃蛋白粉增溶改性的最適用酶，并進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 蛋白酶種類對氮溶指數(shù)和水解度的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶用量的確定

以酶用量為0.05%～0.6%，考察酶用量對水解度和氮溶指數(shù)的影響，結(jié)果表明酶用量從0.05%增加到0.3%，氮溶指數(shù)上升較明顯，水解度也明顯增加，而酶用量繼續(xù)增加到0.6%時(shí)，氮溶指數(shù)上升的幅度明顯減少并趨于穩(wěn)定（圖2），表明當(dāng)酶用量在0.3%以內(nèi)時(shí)，底物沒有被酶飽和，增加酶用量可以使底物充分地參與反應(yīng)。而酶用量超過0.3%后，氮溶指數(shù)沒有明顯增加，水解度卻有明顯增加，表明過多的酶用量不但不能使氮溶指數(shù)升高，反而使可溶性的酶解產(chǎn)物繼續(xù)被酶解，從而導(dǎo)致水解度升高且產(chǎn)生苦味肽。因此，確定0.3%酶用量為酶解增溶改性單因素最佳條件。

圖2 不同酶用量對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響

2.2.2 底物濃度的確定

從圖3中可以看出，隨著液料比從6∶1增加到10∶1，酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)逐漸增加，液料比繼續(xù)增加到16∶1時(shí)，氮溶指數(shù)基本保持不變并逐漸減少；而水解度隨著液料比的增加不斷提高，尤其是當(dāng)液料比大于12∶1時(shí)，增加速度明顯加快。表明當(dāng)分散液較濃稠時(shí)，蛋白酶與底物的接觸不夠充分，從而導(dǎo)致氮溶指數(shù)和水解度均較低，當(dāng)分散液稀釋到一定程度時(shí)，酶與底物充分接觸，將不溶性蛋白水解成可溶性蛋白，而繼續(xù)稀釋會使可溶性蛋白繼續(xù)水解成小分子的肽，形成的部分疏水性肽導(dǎo)致氮溶指數(shù)逐漸下降。因此，確定液料比10∶1為本試驗(yàn)的最佳單因素條件。

圖3 不同液料比對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響

2.2.3 酶解溫度的確定

由圖4可知，隨著酶解溫度從30℃增加到40℃，酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)增加，表明相對較高的溫度能使蛋白酶的活力得到充分發(fā)揮，而隨著溫度繼續(xù)上升到70℃，酶解產(chǎn)物氮溶指數(shù)逐漸下降，而水解度卻隨著溫度上升逐漸增加，表明過高的溫度會提高體系內(nèi)分子運(yùn)動的激烈程度，增加蛋白酶和底物的碰撞幾率，從而使蛋白水解速度加快，過度的水解還會產(chǎn)生不溶性的肽。因此，為了在較低水解度的前提下提高水解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)，確定單因素最佳溫度為40℃。

圖4 不同溫度對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響

2.2.4 酶解時(shí)間的確定

試驗(yàn)考察了10～60 min內(nèi)不同酶解時(shí)間對產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響。從圖5中可以看出，隨著酶解時(shí)間從10 min增加到40 min，酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)隨之顯著增加，說明蛋白酶需要一段時(shí)間才能相對充分的與蛋白質(zhì)作用，從而達(dá)到較好的增溶效果。而隨著酶解時(shí)間繼續(xù)增加到60 min，氮溶指數(shù)的增加逐漸緩慢，水解度的增加也趨于平緩，因?yàn)槊盖形稽c(diǎn)逐漸減少，酶的活力也逐漸下降，導(dǎo)致氮溶指數(shù)和水解度增長緩慢。因此，確定單因素最佳酶解時(shí)間為40 min。

圖5 不同酶解時(shí)間對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)和水解度的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定胰蛋白酶作為核桃蛋白粉有限酶解增溶改性用酶，同時(shí)確定液料比為10∶1，設(shè)定響應(yīng)面優(yōu)化的三因素分別為酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量。二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果和回歸分析見表3～表4。

為考察各因子對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)的影響，以氮溶指數(shù)為指標(biāo)，對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到三因子與酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)的回歸方程：

表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

表4 方差分析

從方差分析結(jié)果（表4）可以看出，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F1值為272.01（P＜0.000 1），表明回歸方程擬合度達(dá)到極顯著水平。失擬性檢驗(yàn)F2值為1.57（P＝0.412 6＞0.05），差異不顯著，表明回歸方程無失擬因素存在。且回歸模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 0，說明模型成立且可靠。由因子方差分析可知，酶解溫度（X1）、酶解時(shí)間（X2）和酶用量（X3）對 NSI的影響均較大（P＝0.000 5、0.000 1和0.000 1＜0.05），其中溫度與酶用量，時(shí)間與酶用量之間存在顯著的交互作用（P＜0.01）。剔除α＝0.05顯著水平不顯著項(xiàng)后，簡化后的回歸方程如式（4）：

通過對方程（4）中的X1、X2、X3求偏導(dǎo)，得出X1＝0.290，X2＝0.598，X3＝0.601，即以 NSI為指標(biāo)有限酶解核桃蛋白粉的最佳工藝條件為酶解溫度42.90℃，酶解時(shí)間51.96 min，酶用量0.42%。

由二次回歸方程及圖6中響應(yīng)面的等高線圖分析可知，酶用量與溫度、時(shí)間的交互作用對核桃蛋白酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)有顯著影響，而溫度和時(shí)間的交互作用不顯著。擬合的等高線圖能直觀地反應(yīng)各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，圖6中極高值對應(yīng)2個(gè)因素在另1個(gè)因素0水平時(shí)的酶解產(chǎn)物氮溶指數(shù)最大值。在酶解溫度和酶用量對氮溶指數(shù)的交互作用中，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨酶用量增加，氮溶指數(shù)呈上升趨勢，而當(dāng)溫度較高時(shí)，隨酶用量的增加，氮溶指數(shù)先增加較快，后趨于平緩且有所下降；在酶解時(shí)間和酶用量對氮溶指數(shù)的交互作用中，當(dāng)時(shí)間較短時(shí)，隨著酶用量的增加，氮溶指數(shù)迅速增加，而當(dāng)酶解時(shí)間較長時(shí)，隨酶用量的增加，氮溶指數(shù)增加較緩慢，當(dāng)酶用量處于較高水平時(shí)，氮溶指數(shù)反而下降。與單因素試驗(yàn)相比較，各個(gè)因素對酶解產(chǎn)物氮溶指數(shù)的影響趨勢基本一致，二次回歸方程的模擬情況基本能夠反映實(shí)際。

圖6 因子交互作用的等高線圖

2.4 優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)

在理論最佳條件酶解溫度42.90℃，酶解時(shí)間51.96 min，酶用量0.42%的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可靠性，將工藝參數(shù)修正為液料比10∶1，酶解溫度43℃，酶解時(shí)間52 min，酶用量0.4%，此時(shí)的NSI的預(yù)測值為78.57%。按照修正參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)的核桃蛋白有限酶解驗(yàn)證試驗(yàn)，得到核桃蛋白粉酶解后的NSI實(shí)際值為（78.16±1.49）%與模型預(yù)測值78.57%相符，可用于實(shí)際操作。

2.5 有限酶解對核桃蛋白功能特性的影響

以響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝參數(shù)制備有限酶解改性核桃蛋白粉，測定了改性后核桃蛋白的乳化特性、起泡特性等功能特性，結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出有限酶解改性對核桃蛋白的其他功能特性也有顯著的影響，這是由于蛋白質(zhì)的溶解性會影響其他功能特性，一般情況下，具有較好溶解性的蛋白質(zhì)也會有較好的其他功能特性［15］。改性后核桃蛋白粉的乳化性有明顯的提高，而乳化穩(wěn)定性卻顯著降低，這可能是由于有限酶解會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的打開，使非極性基團(tuán)暴露在蛋白分子表面，同時(shí)生成的小部分肽會停留在油滴表面使乳化液的穩(wěn)定性下降［16］。改性后核桃蛋白粉的起泡性和起泡穩(wěn)定性均有極顯著的提高，這是由于有限酶解后形成的可溶性大分子多肽鏈具有較高的表面活性［17］。

表5 有限酶解改性后核桃蛋白的乳化特性和起泡特性

3 結(jié)論

以冷榨核桃粕為原料，經(jīng)超細(xì)粉碎后獲得核桃脫脂粉，選擇胰蛋白酶作為改性用酶對其進(jìn)行有限酶解增溶改性。通過單因素試驗(yàn)確定胰蛋白酶增溶改性核桃蛋白的工藝條件為：液料比10∶1，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間40min，酶用量0.3%；采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)確定了胰蛋白酶有限酶解核桃蛋白的最佳工藝為液料比10∶1，酶解溫度43℃，酶解時(shí)間52 min，酶用量0.4%，在此最佳條件下制備的核桃蛋白水解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)達(dá)到78.16%，同時(shí)其水解度經(jīng)測定僅為3.25%，沒有形成苦味等不良感官品質(zhì)，保持了核桃蛋白粉固有的特征風(fēng)味。本研究使核桃蛋白粉的氮溶指數(shù)從8.74%顯著提升到78.16%，其乳化特性和起泡特性也得到了明顯的改善，且操作簡單、條件溫和、成本低廉，使核桃蛋白的應(yīng)用不再受到水溶性差的限制，大大拓展了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。

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Process of Sulobilization and Modification of Limited Enzymatic Hydrolysis from Walnut Protein

Shen Minjiang1，2Wang Wenhui1Liu Li2Liu Hongzhi2Wang Qiang2
（Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences1，Xingcheng 125100）（Key Laboratory of Agro－Products Processing，Ministry of Agriculture，Institute of Agro－Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences2，Beijing 100193）

In order tomake full use of thewalnutmeal after extraction ofwalnut oil and broaden the application range in the food industry ofwalnut protein，the process of sulobilization andmodification of limited enzymatic hydrolysis from walnut protein was studied to increase the product additive value.The effect of different enzymes on the degree of hydrolysis（DH）and NSIwere compared，and trypsin was used to limited hydrolyzewalnut protein as the best enzyme.On the base of single factor experiments，the optimum conditions of limited enzymatic hydrolysiswere evaluated by quadratic regression orthogonal rotational combing design.The results showed that the optimum conditions were ratio of liquid to solid of 10∶1，enzymolysis temperature of 43℃，enzymolysis time of 52 min and dosage of trypsin of 0.4%.Under the optimum conditions，the DH ofmodified walnut protein was as low as3.25%，while the NSIofwalnut protein was significantly improved from 8.74%to 78.16%.

walnut protein，protease，limited hydrolysis，solubility，optimization of process

TQ432.2

A

1003－0174（2015）08－0093－06

國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD27B00）

2014－03－10

沈敏江，男，1986年出生，碩士，糧油加工與功能食品

王強(qiáng)，男，1965年出生，研究員，糧油加工與功能食品