超濾精制對芝麻蛋白水解液ACE抑制活性和抗氧化活性的影響

王振斌 裴娟娟 閆景坤 馬海樂 王 林 姜美花

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

超濾精制對芝麻蛋白水解液ACE抑制活性和抗氧化活性的影響

王振斌 裴娟娟 閆景坤 馬海樂 王 林 姜美花

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

以芝麻餅粕為原料，采用超濾技術(shù)制備功能多肽，研究超濾對蛋白酶水解肽的氨基酸組成、肽譜、降血壓和抗氧化功能特性等影響。結(jié)果表明：經(jīng)截留分子質(zhì)量為10 ku和3 ku的超濾膜過濾，所得到的3個(gè)組分（相對分子質(zhì)量分布＞10 ku、3～10 ku和＜3 ku）的必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.6%、14.9%、15.0%，顯著高于未經(jīng)超濾（12.9%），分子質(zhì)量分布在3～10 ku組分的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)53.1%，比未經(jīng)超時(shí)提高了7.6%；其中分子質(zhì)量分布為3～10 ku和＜3 ku酶解液的IC50值分別降低了6.6%和7.9%，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制活性顯著提高；分子質(zhì)量分布為3～10 ku和＜3 ku酶解液的DPPH·自由基清除率IC50值與未經(jīng)超濾時(shí)均降低了8.6%，羥自由基清除率分別降低4.20%和26.57%，抗氧化活性顯著提高。

超濾 芝麻餅粕 多肽 ACE抑制活性 抗氧化活性

我國芝麻餅粕資源豐富，年產(chǎn)量在50萬t以上。芝麻餅粕中含30%～50%的蛋白質(zhì)，含有人體必需氨基酸，并且氨基酸配比良好。然而，目前芝麻餅粕尚未得到充分的利用，未能體現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值。研究表明，許多植物蛋白酶解后會(huì)產(chǎn)生具有降血壓功能的活性肽，并且已從多種食用蛋白酶解液中分離出具有生物活性的降血壓片段［1］。因此，利用資源豐富、營養(yǎng)價(jià)值高的芝麻餅粕蛋白制備功能性多肽具有廣闊的應(yīng)用前景。

多肽的降血壓和抗氧化功能備受關(guān)注，一方面是由于高血壓人群不斷增加，而常用的卡托普利等口服降壓藥品對肝臟、腎臟等人體器官會(huì)產(chǎn)生毒副作用；另一方面食品行業(yè)中廣泛使用的一些人工合成抗氧化劑如 BHA、BHT和 PG等潛在的危害性［2］。因此，近年來利用動(dòng)植物資源制備抗氧化肽的研究成為熱點(diǎn)。為了制備高活性、組分明確的多肽，同時(shí)兼顧商業(yè)化生產(chǎn)，對多肽進(jìn)行分離純化是必要的環(huán)節(jié)。

超濾（Ultra Filtration，UF）是膜分離技術(shù)的一種，以膜兩側(cè)的壓力差為推動(dòng)力，溶液的溶劑與部分低分子質(zhì)量溶質(zhì)穿過膜上微孔到達(dá)膜的另一側(cè)，而高分子溶質(zhì)或其他乳化膠束團(tuán)被截留。超濾技術(shù)具有其他分離操作不具有的優(yōu)點(diǎn)，如無相變、無需加熱、占地面積小、設(shè)備簡單等。因此，超濾技術(shù)在食品行業(yè)中應(yīng)用越來越廣泛，特別是在降血壓肽和抗氧化肽的分離純化中［3］。然而，關(guān)于芝麻餅粕蛋白酶解制備活性多肽的研究中，采用膜分離法探討活性多肽的分子質(zhì)量分布與其降血壓和抗氧化活性之間的關(guān)系目前還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用超濾技術(shù)對芝麻蛋白水解液進(jìn)行分離，研究超濾對蛋白酶水解活性多肽的氨基酸組成、肽譜、降血壓和抗氧化功能特性的影響，為推動(dòng)芝麻餅粕深加工，提高其附加值；同時(shí)，為降低降血壓肽和抗氧化肽的生產(chǎn)成本提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

芝麻蛋白水解液，自制（芝麻餅粕10 g，加入蒸餾水 100 mL，最優(yōu)酶解條件：pH 8.8，酶解溫度46℃，底物濃度8.5%，加酶量2 000 u/g，酶解時(shí)間24 min）；馬尿酰組氨酰亮氨酸（N－Hippuryl－L－h(huán)istidyl－L－leucine，HHL）、1，1－二苯基 －2－三硝基苯肼（DPPH·）：Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

截留分子質(zhì)量為10 ku和3 ku的Pellicon系列纖維素平板膜：Millipore公司；BT00－300蠕動(dòng)泵：常州市誠和衛(wèi)生設(shè)備廠；SykamS433D/S433（塞卡姆）氨基酸分析儀：德國Sykam公司；ZORBAX Eclipse XEB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）：Agilent公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 芝麻蛋白水解液的酶法制備

稱取芝麻餅粕850 g，加入蒸餾水10 L，46℃，pH 8.8條件下，添加2 000 u/g堿性蛋白酶，酶解24 min。整個(gè)酶解過程中，用1 mol/L的 NaOH保持酶解液pH的穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸，滅酶15 min。然后于5 000 r/min條件下，離心15 min，取上清液備用。

2.2 芝麻蛋白水解液的超濾分離

如圖1所示。將芝麻餅粕酶解液，先經(jīng)真空抽濾（Φ9 cm）后依次通過截留分子質(zhì)量為10 ku（一級超濾）和3 ku（二級超濾）的平板膜，將分子質(zhì)量在10 ku以上、3～10 ku和3 ku以下的產(chǎn)物收集濃縮后冷凍干燥。超濾條件如下：截留分子質(zhì)量為10 ku的一級超濾時(shí)，操作壓力為0.5 kg/cm2、酶解液溫度為33℃；截留分子質(zhì)量為3 ku的二級超濾時(shí)，操作壓力0.8 kg/cm2、酶解液溫度為33℃。

圖1 超濾流程示意圖

2.3 超濾后芝麻蛋白水解液的肽譜分析

對超濾后所得的4個(gè)分子質(zhì)量段的芝麻蛋白水解液和堿提芝麻蛋白—分子質(zhì)量（MW）小于3 ku、MW（3～10 ku）、MW＞10 ku、堿提芝麻蛋白，用高效液相色譜測定其肽譜。

高效液相色譜測定條件如下：ZORBAX－C18柱（4.6×250 mm，填料粒徑5μm）；柱溫28℃；檢測波長215 nm；進(jìn)樣量10μL；洗脫液為超純水－乙腈（80∶20，各含 0.5‰三氟乙酸）；流速為 1 mL/min，洗脫時(shí)間為25 min。

2.4 芝麻蛋白水解液氨基酸組成分析

超濾后各組分的氨基酸（Amino acid，AA）組成用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。具體操作如下：稱取一定量樣品置于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，真空封口，于110℃進(jìn)行蛋白水解24 h，放置冷卻，過濾、定容。取0.5 mL濾液蒸干，加少許水，反復(fù)蒸干1～2次。加入2 mL樣品稀釋液，振蕩混勻，0.22μm濾膜過濾后，進(jìn)行氨基酸組成分析。

2.5 芝麻蛋白水解液的半抑制濃度測定

參照吳瓊英等［4］的研究方法并稍作修改。準(zhǔn)確吸取10μL樣品于1.5 mL離心管中，加入25μL ACE（1 u ACE溶于 10 mL的 pH 8.3、0.1 mol/L的硼酸緩沖液中，該緩沖液含0.3 mol/L NaCl），37℃保溫5 min，隨后加入 6.5 mmol/L HHL 40μL，在 37℃恒溫反應(yīng)30 min，然后加入85μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，所得反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析。用10μL pH 8.3硼酸緩沖液作空白對照試驗(yàn)。

HPLC條件：ZORBAX－C18柱（4.6×150 mm，填料粒徑5μm）；檢測波長228 nm；進(jìn)樣量8μL；柱溫25℃；流動(dòng)相為超純水－乙腈（80∶20，各含0.5‰三氟乙酸）；流速1.0 mL/min。ACE抑制率計(jì)算公式如下：

式中：R為CE抑制率/%；A為空白對照組Hip的峰面積；B為添加芝麻蛋白水解液組Hip的峰面積。

稱取一定質(zhì)量樣品配成不同濃度的溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算IC50值。

2.6 超濾后各組分抗氧化活性測定

2.6.1 清除DPPH·自由基

將芝麻蛋白水解液稀釋成不同的濃度，分別取2 mL樣品，加入 0.04 g/L 1，1－二苯基 －2－三硝基苯肼（DPPH·）無水乙醇溶液2 mL，混勻，反應(yīng)20 min，離心10 min，取上清液于517 nm波長處測定其吸光值［4］。按下式計(jì)算樣品對DPPH·自由基的清除率：

樣品對DPPH·自由基的清除率＝

式中：A1為水解液與DPPH·溶液反應(yīng)后測得的吸光度；A2為無水乙醇代替水楊酸溶液測得的吸光度；A0為蒸餾水代替水解液測得的吸光度。

同時(shí)配制不同濃度的抗壞血酸（VC）溶液，按照上述方法測定VC對DPPH·自由基的清除率。

2.6.2 清除羥自由基

將芝麻蛋白水解液稀釋成不同的濃度，分別取2 mL，加2 mL硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L），2 mL H2O2溶液（6 mmol/L），混勻，靜置 10 min，再加 2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L），混勻，靜置 20 min，3 500 r/min離心10min，取上清液，于510 nm波長處測定其吸光值［5］。按下式計(jì)算樣品對羥自由基的清除率：

式中：A1為水解液與水楊酸溶液反應(yīng)后測得的吸光度；A2為蒸餾水代替水楊酸溶液測得的吸光度；A0為蒸餾水代替水解液測得的吸光度。

同時(shí)配制不同濃度的抗壞血酸（VC）溶液，按照上述方法測定VC對羥自由基的清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 超濾后芝麻蛋白水解液的肽譜分析

高效液相色譜（HPLC）法所得到的肽譜常用于蛋白質(zhì)或多肽的鑒定以及突變點(diǎn)的檢測。芝麻蛋白水解液經(jīng)分子質(zhì)量為10 ku和3 ku的超濾膜過濾后所得到的不同分子質(zhì)量的組分，用高效液相色譜作肽指紋圖譜，通過肽譜的變化可以直觀地反映芝麻蛋白水解液經(jīng)過膜濾后的變化情況。

圖2 超濾后各各組分的肽譜

從圖2可以看出，芝麻餅粕酶解液和堿提芝麻蛋白主要有3個(gè)組分峰，并且酶解液的峰面積較堿性蛋白大，尤其是前面2個(gè)峰面積是堿性蛋白峰面積的4倍左右。酶解液經(jīng)過10 ku的膜過濾后，分子質(zhì)量大于10 ku的芝麻蛋白水解液只有2個(gè)組分峰，保留時(shí)間為2.09 min的組分峰基本消失。經(jīng)過3 ku的膜過濾后，分子質(zhì)量在3～10 ku以及小于3 ku的芝麻蛋白水解液在1.43、1.09 min和1.45、1.91 min出的組分峰面積明顯高于未過膜的芝麻蛋白水解液，其中分子質(zhì)量小于3 ku的組分峰更顯著。從肽譜可以看出，經(jīng)過兩級分子質(zhì)量超濾膜過濾后各分子質(zhì)量ACE抑制肽的組分有了顯著的變化；同時(shí)，經(jīng)過兩級超濾之后隨著分子質(zhì)量的減少，分離出更多的肽。這也說明，具有活性的多肽與酶解液中的其他成分混合在一起，未能有效的分離開來。因此，用超濾的方法進(jìn)行初級純化多肽產(chǎn)品是有必要的。

3.2 超濾后芝麻蛋白水解液的氨基酸分析

對芝麻蛋白水解液進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，芝麻蛋白水解液的氨基酸種類豐富，含有17種氨基酸（色氨酸未測），其中8種為人體必需氨基酸。質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的氨基酸為谷氨酸（Glu），在超濾前后樣品中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.3%、10.4%、13.6%、12.5%，雖然不是人體必需氨基酸，但對機(jī)體代謝和細(xì)胞增殖具有重要作用［6］。其次為精氨酸（6.5%、6.0%、6.9%、6.5%）和天冬氨酸（4.0%、4.5%、5.3%、4.1%）。芝麻蛋白水解液中含有的必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)符合FAO/WHO推薦模式［7］。對酶解得到的芝麻蛋白水解液采用超濾的方法進(jìn)行分離，超濾后必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.6%、14.9%、15.0%，明顯高于未經(jīng)超濾的12.9%。此外，總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有提高，分子質(zhì)量分布在3～10 ku范圍的組分的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)53.1%，提高了7.6%。

表1 不同分子質(zhì)量芝麻蛋白水解液的氨基酸組成（g/100 g蛋白質(zhì)）

3.3 超濾對ACE抑制活性的影響

姜瞻梅［8］選用10 ku和3 ku的超濾膜對酪蛋白酶解物進(jìn)行超濾，發(fā)現(xiàn)隨著分子質(zhì)量的減小，超濾物的ACE抑制活性逐漸提高。何榮海等［9］研究條斑紫菜ACE抑制肽時(shí)也發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量越小，超濾物的ACE抑制活性越高。然而，Mullally等［10］對乳清蛋白的胰蛋白酶酶水解物進(jìn)行超濾處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管超濾物的活性比原水解物高，但小于1 ku組分的ACE抑制活性低于小于3 ku組分的抑制活性，這些結(jié)果表明較小分子截留量的超濾膜容易造成料液中有效成分的損失。因此，本試驗(yàn)選用10 ku和3 ku 2種超濾膜。經(jīng)10 ku和3 ku超濾膜后的不同分子質(zhì)量范圍的芝麻蛋白水解液的ACE抑制活性有一定變化，結(jié)果見表2。

表2 超濾后各組分ACE抑制活性的IC50值

超濾后，分子質(zhì)量大于10 ku的組分IC50值大于超濾前的3.03 mg/mL；分子質(zhì)量在3～10 ku組分的IC50值比超濾前小，說明ACE抑制活性得到了提高；分子質(zhì)量小于3 ku組分的IC50值最低，從超濾前的3.03 mg/mL下降到 2.79 mg/mL，提高了 ACE抑制活性，說明起降血壓作用的多肽多為短肽。

經(jīng)不同分子質(zhì)量大小的超濾膜之后，ACE抑制活性發(fā)生變化，說明具有ACE抑制活性的多肽分子質(zhì)量分布廣；同時(shí)也說明酶解液中混雜著不同分子質(zhì)量的ACE抑制肽、氨基酸、以及其他雜質(zhì)，從而使得具有ACE抑制活性的肽片段純度不高。

3.4 超濾對各組分抗氧化活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性的多肽也具有不同程度的抗氧化活性［11］。同時(shí)，Gao等［12］、Moure等［13］和 Mamelona等［14］研究發(fā)現(xiàn)抗氧化活性肽的抗氧化活性與相對分子質(zhì)量有很大的關(guān)系。Raghavan等［15］和 Tang等［16］認(rèn)為相對分子質(zhì)量小的肽段具有更高的抗氧化能力。蘇春燕［17］采用超濾、大孔吸附樹脂分級、MALDI－TOF－TOF MS法測得抗氧化中主要成分的相對分子質(zhì)量為951u和1 349 u。任海偉等［18］研究谷朊粉抗氧化肽的活性，也認(rèn)為抗氧化活性肽主要集中在低相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)。因此，本試驗(yàn)對芝麻ACE降血壓肽超濾前后各組分進(jìn)行了抗氧化活性測定。

3.4.1 清除DPPH·自由基能力

經(jīng)過超濾后，各組分的DPPH·自由基清除率見表3。芝麻蛋白水解液的 IC50為 0.35 mg/mL，是VCIC50（0.003 4 mg/mL）的 102.85倍。盡管芝麻蛋白水解液對清除DPPH·自由基效果遠(yuǎn)不如VC，但是本試驗(yàn)得到的芝麻蛋白水解液的IC50比曹輝等［19］制備得到的抗氧化肽（IC50＝0.93 g/L）、李丹等［20］制備得到的高純度大豆低聚肽（IC50＝52.85 mg/mL）小，對于后期的研究具有一定的參考價(jià)值。

表3 超濾后各組分清除DPPH·自由基的IC50

經(jīng)3 ku和10 ku超濾膜之后的組分對DPPH·自由基的清除率較超濾前有提高。從表3中可看出分子質(zhì)量＜3 ku的組分效果最好，小于超濾前酶解液的 IC50值（0.35 mg/mL），可見超濾后清除率得到了提高。

3.4.2 清除羥自由基能力

VC和芝麻蛋白水解液超濾前后均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥自由基的能力，如表4所示。芝麻蛋白水解液的 IC50為1.43 mg/mL，是 VC IC50（0.30 mg/mL）的4.76倍，且該值低于部分文獻(xiàn)報(bào)道［21］。由此可知，芝麻蛋白水解液制備ACE抑制肽具有一定的清除羥自由基的能力。

表4 超濾后各組分清除率羥自由基的IC50

4 結(jié)論

4.1 經(jīng)過10 ku和3 ku超濾膜之后，其氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較未經(jīng)超濾時(shí)的45.50%分別提高到48.00%、53.10%、50.30%，其變化主要是由影響ACE抑制活性的精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸等氨基酸引起的。

4.2 分子質(zhì)量為10 ku和3 ku超濾膜對芝麻蛋白水解液ACE抑制活性有提高作用。分子質(zhì)量大于10 ku、3～10 ku、小于 3 ku 3個(gè)組分 IC50值分別為4.31、2.83和 2.79 mg/mL，同時(shí)起降血壓作用的多肽多為短肽。

4.3 堿提蛋白、芝麻餅粕酶解物、大于10 ku組分、3～10 ku組分、小于3 ku組分分別出現(xiàn)3、3、2、4、7個(gè)峰，隨著分子質(zhì)量的減小，出現(xiàn)的組分峰越多，并且其峰面積也明顯變大。因此，用超濾的方法進(jìn)行初級純化多肽產(chǎn)品以提高其ACE抑制活性的效果是比較理想的。

4.4 芝麻餅粕酶解液具有一定的體外抗氧化能力，并且分子質(zhì)量越小，其抗氧化活性越強(qiáng)。酶解液和超濾后各組分清除DPPH·和羥自由基的IC50值分別為0.35和 1.43 mg/mL、0.41和1.75 mg/mL、0.32和1.37 mg/mL、0.32和 1.05 mg/mL。

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Effects of Ultrafiltration on ACE－Inhibitory and Antioxidant Activities of Sesame Protein Hydrolysates

Wang Zhenbin Pei Juanjuan Yan Jingkun Ma Haile Wang Lin Jiang Meihua
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

In order to explore the application of ultrasonic andmicrowave technology in sesame cake ACE inhibitory peptide preparation，sesame cakeswere treated with ultrasonic，microwave and ultrasonic－assisted enzymolysis to study the effect of power，time and enzyme dosage on inhibition rate of ACE.The optimal conditions of ultrasonic treatment were power of4W/mL，time of10min and alkaline protease of1 300 u/g，and IC50value of ACE inhibitory peptide was 2.81 mg/mL.The optimal conditions of ultrasonic－assisted enzymolysis were power of 0.5 W/mL and alkaline protease of1 700 u/g for 15 min，and IC50value of ACE inhibitory peptidewas2.96 mg/mL.The optimal conditions ofmicrowave treatmentwere power of1.33W/mL for5 min，and IC50value of ACE inhibitory peptide was 2.81 mg/mL.

ultrafiltration，sesame cake，peptide，ACE inhibitory activity，antioxidant activity

TS229

A

1003－0174（2015）08－0058－06

蘇北科技發(fā)展計(jì)劃（BC2012421），江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（蘇政辦發(fā)［2014］37號），江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（201310299 019Z），江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)資助項(xiàng)目（12A018）

2014－03－20

王振斌，男，1975年出生，教授，天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用

閆景坤，男，1980年出生，副教授，天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用