響應(yīng)面優(yōu)化無(wú)患子皂苷超聲輔助提取工藝

但漢龍，李 娜，葉紅蓮，劉 云，王連春，趙 平

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 云南 昆明 650224 )

響應(yīng)面優(yōu)化無(wú)患子皂苷超聲輔助提取工藝

但漢龍1，2，李 娜1，2，葉紅蓮2，劉 云2，王連春2，趙 平1，2

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 云南 昆明 650224 )

采用超聲輔助提取法從無(wú)患子果皮中提取無(wú)患子皂苷，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比以及提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響，并采用響應(yīng)面法確定無(wú)患子皂苷的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)82.2%、提取時(shí)間33.75 min、料液比1:28.9、提取次數(shù)4次，在此優(yōu)化條件下無(wú)患子皂苷的理論提取率可達(dá)到21.52%。依實(shí)際試驗(yàn)情況，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、提取時(shí)間34 min、料液比1:29、提取次數(shù)4次，經(jīng)驗(yàn)證此條件下無(wú)患子皂苷提取率為21.48%，與理論值較為接近，表明采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化無(wú)患子皂苷超聲輔助提取工藝的方法可行。

無(wú)患子；無(wú)患子皂苷；超聲輔助提取；響應(yīng)面法

無(wú)患子Sapindus mukorossi又名肥皂樹(shù)、油患子、菩提子等，是無(wú)患子科Sapindaceae無(wú)患子屬Sapindus落葉喬木，原產(chǎn)我國(guó)長(zhǎng)江流域以南及中南半島、印度和日本等各地，我國(guó)廣東、福建、廣西、江西、浙江、云南等地均有栽培，為低山丘陵及石灰?guī)r山地常見(jiàn)樹(shù)種[1]。無(wú)患子皂苷是無(wú)患子果皮的主要有效成分[2]，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3]、抗炎[4]、抗菌[5]、抗真菌[6]、保肝[7]、抗血小板凝集[8]、降血壓[9]、降血糖和降血脂[10]、殺蟲(chóng)[11]和滅螺[12]等多種藥理活性，且具良好的去污、起泡效果[13]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、日用品和化妝品等行業(yè)[14]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)法對(duì)無(wú)患子皂苷提取工藝開(kāi)展了一些研究，主要包括水或醇提法[15-17]、微波輔助提取法[18-20]、超聲輔助提取法[21-23]和纖維素酶法[24]等。金秋等[25]比較了回流提取、索氏提取、微波輔助提取和超聲輔助提取等不同提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取法的提取效率明顯優(yōu)于其他方法。與傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)法相比較，響應(yīng)面法目前已成為工藝條件等目標(biāo)優(yōu)化的一種有效的設(shè)計(jì)分析方法，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生物等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[26-29]。本研究以滇產(chǎn)無(wú)患子果皮為原料，采用超聲輔助法提取無(wú)患子皂苷，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)患子皂苷的超聲輔助提取工藝，以期為云南省無(wú)患子植物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

無(wú)患子采自云南省建水縣李浩寨鄉(xiāng)，其果皮自然晾干后經(jīng)粉碎過(guò)40目篩后備用。齊墩果酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、甲醇和丙酮均為分析純，水為重蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1000 紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）、四兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）、N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械公司）、CP224C型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、LU10AT型超聲波儀（FUNGILABS. B）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照毛得獎(jiǎng)等[30]的方法，精密稱取齊墩果酸對(duì)照品3.0 mg，配成0.3 mg/mL的甲醇溶液。分別取0，0.2，0.4，0.6，1.2，1.4 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，揮干試劑后加入5%香草醛/冰醋酸0.2 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）、高氯酸0.8 mL混勻，60℃水浴加熱15 min，取出后立刻用流水冷卻，加5 mL冰醋酸稀釋混勻，以空白試管中溶液作為空白對(duì)照，測(cè)550 nm處的吸光度值，重復(fù)三次。計(jì)算回歸方程為y=38.243x+0.016 3（R2= 0.999 0），線性范圍11.8～82.6 μg/mL，線性關(guān)系良好。

1.3.2 樣品皂苷含量測(cè)定及其提取率計(jì)算

精密稱取1.000 g無(wú)患子果皮粉末，在不同條件下進(jìn)行超聲提取，所得提取液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋、定容于25 mL容量瓶中，然后從中取0.5 mL溶液于干凈試管中，減壓濃縮揮干試劑后按1.3.1所示方法進(jìn)行操作，將測(cè)得的樣品吸光度值帶入上述回歸方程，并結(jié)合稀釋倍數(shù)求得提取液中的皂苷質(zhì)量（g），按下式計(jì)算樣品在不同提取條件下的皂苷提取率：皂苷提取率/%= [皂苷含量（g）/無(wú)患子質(zhì)量（g）] × 100%。

1.3.3 提取溶劑選擇

精密稱取1.000 g 無(wú)患子果皮粉末，以料液比1∶20分別加入體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%和100%的甲醇、乙醇和丙酮超聲提取1次，時(shí)間40 min，所得各提取液按1.3.2方法測(cè)定并計(jì)算皂苷提取率，以確定最佳提取溶劑。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

精密稱取1.000 g 無(wú)患子果皮粉末，利用超聲波輔助乙醇提取法，分別考察不同超聲提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）對(duì)皂苷提取率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)三次，以確定各因素的恰當(dāng)范圍。

1.3.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、液料比、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，利用Design-Expert V 8.0.6軟件，按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以皂苷提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平共30個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，每組重復(fù)三次。使用上述軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，求出數(shù)學(xué)模型，以確定無(wú)患子皂苷的最佳提取工藝條件。

1.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)操作需要，對(duì)1.3.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得的最佳理論提取工藝條件進(jìn)行適當(dāng)修正后，精密稱取1.000 g 無(wú)患子果皮粉末進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)實(shí)際所得的皂苷提取率與回歸方程優(yōu)化所得的理論預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證響應(yīng)面法所得的試驗(yàn)參數(shù)是否準(zhǔn)確可靠。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑選擇

不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇和丙酮作為提取溶劑對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，體積分?jǐn)?shù)較低的丙酮提取所得的皂苷提取率高于相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和甲醇所得的提取率，60%和80%的丙酮和乙醇所得的提取率較高且較為接近，但高體積分?jǐn)?shù)丙酮的提取率明顯低于乙醇和甲醇。綜合考慮溶劑成本和毒性等因素，選擇80%乙醇作為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響Fig.1 Effects of different extraction agents on extraction rate of sapindus-saponin

2.2 單因素試驗(yàn)

不同超聲提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2a可知，提取時(shí)間在30 min時(shí)，無(wú)患子皂苷提取率達(dá)到最高，之后皂苷提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，這可能是由于超聲時(shí)間的延長(zhǎng)增加了超聲波的作用強(qiáng)度，導(dǎo)致樣品中的皂苷受到破壞所致[31]。因此，確定最佳的超聲提取時(shí)間為30 min。

由圖2b可知，液料比在1∶10～1∶30區(qū)間內(nèi)，皂苷提取率隨液料比的增加而上升。當(dāng)液料比在1∶30時(shí)，皂苷提取率達(dá)到最高。當(dāng)液料比大于1∶30后，皂苷提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槿軇┝窟^(guò)大導(dǎo)致皂苷濃度下降而不利于協(xié)同浸提，從而導(dǎo)致提取率下降[32]。因此，液料比確定為1∶30。

由圖2c可知，提取次數(shù)在1～3次之間，皂苷提取率隨提取次數(shù)的增加而顯著上升，提取次數(shù)超過(guò)3次后，皂苷提取率的上升幅度趨于相對(duì)平緩?？紤]到節(jié)約成本等因素，確定提取次數(shù)為3次。

由圖2d可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，皂苷提取率呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，提取率達(dá)到最高，因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖2 提取時(shí)間（a）、料液比（b）、提取次數(shù)（c）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（d）對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響Fig. 2 Effects of extraction time (a), solid-liquid ratio (b), extraction times (c) and concentration of ethanol (d) on extraction rate of sapindus-saponin

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以無(wú)患子皂苷提取率為響應(yīng)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）4因素為自變量，每個(gè)因素取3個(gè)水平以（-1，0，1）編碼，4因素的3水平分別選取見(jiàn)表1所示。

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2所示，本次試驗(yàn)共30有個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，6個(gè)中心點(diǎn)，總計(jì)25個(gè)分析因子，各個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)以隨機(jī)順序進(jìn)行，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值作為結(jié)果。

表1 響應(yīng)曲面條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels for response surface optimization test

表2 中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性檢測(cè)

經(jīng)回歸擬合后，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示：提取率/%=-3.30781+0.462 06A+0.155 02B+ 0.194 77C+0.091 875D-1.437 5x10-4AB-1.618 75x10-3AC+0.013 313AD-5.312 5x104BC+5.937 5x10-3BD+5.187 5x10-3CD-2.819 79x103A2-2.182 29x103B2-1.107 29x103C2-0.183 23D2。

由表3方差分析結(jié)果可知，回歸模型的回歸效果極顯著（p＜0.0001），線性系數(shù)較好（R2=0.9048），說(shuō)明建立的數(shù)學(xué)模型能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，且可用于分析和預(yù)測(cè)響應(yīng)值。表3中的P值大小可判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）四個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)镈＞B＞A＞C；同時(shí)，AC、AD、A2、B2、C2、D2的P值均在0.05以下，其中AC、AD、C2對(duì)皂苷提取率影響顯著，A2、B2、D2對(duì)提取皂苷影響高度顯著。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果?Table 3 Results of variance analysis of regression model

2.3.3 響應(yīng)面分析

利用Design-expert V 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)表3中響應(yīng)面試驗(yàn)中無(wú)患子皂苷提取率數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得二次回歸方程的響應(yīng)面3D圖如圖 3所示。由圖3響應(yīng)面3D圖剖面曲線的陡峭程度結(jié)合表3中的P值大小，可反映兩因素交互作用對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響。

由表3可知PAB＞PCD＞PBC＞PBD＞PAD＞PAC，這說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用對(duì)無(wú)患子皂苷提取率最小，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用對(duì)無(wú)患子皂苷提取率最大。由圖3a可知，無(wú)患子皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加變化不大，提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率影響也較緩慢（PAB＞0.05），說(shuō)明二者交互作用不明顯。由圖3b可知，皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加變化很大，隨著料液比數(shù)的增加變化也較大（PAC＜0.05），表明二者交互作用明顯。由圖3c可看出，皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大變化緩慢，而隨提取次數(shù)的增加快速上升（PAD＜0.05），說(shuō)明二者交互作用明顯。由圖3d可知，皂苷提取率隨著液料比的增加上升緩慢，而隨著超聲時(shí)間的增加總體變化不大（PBC＞0.05），表明二者交互作用不明顯。由圖3e可看出，皂苷提取率隨著提取次數(shù)變化很大，而隨著提取時(shí)間的增大變化緩慢（PBD＞0.05），二者交互作用不明顯。由圖3f可知，料液比不變時(shí)，皂苷提取率隨著提取次數(shù)的增加變化較大，而當(dāng)提取次數(shù)不變時(shí)，皂苷提取率隨著料液比的增加緩慢（PBD＞0.05），說(shuō)明二者交互作用不明顯。

圖3 無(wú)患子皂苷提取率的響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour for interactive effects of different factors on extraction rate of sapindus-saponin

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)回歸方程的優(yōu)化計(jì)算，得到超聲輔助提取無(wú)患子皂苷的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)82.2%、提取時(shí)間33.75 min、料液比1∶28.9、提取次數(shù)4次。在此優(yōu)化條件下，無(wú)患子皂苷提取率的理論預(yù)測(cè)值為21.52%。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)患子皂苷提取工藝的可靠性，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)情況，將上述優(yōu)化條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、提取時(shí)間34 min、料液比1∶29、提取次數(shù)4次，在此條件下提取無(wú)患子皂苷，并做三組重復(fù)試驗(yàn)，得到平均實(shí)際提取率為21.48%，與理論預(yù)測(cè)值較為接近（僅相差0.04%），表明運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定了影響超聲輔助提取無(wú)患子皂苷4個(gè)因素的主次關(guān)系為：提取次數(shù)＞ 提取時(shí)間＞ 乙醇濃度＞料液比，其最佳的理論工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)82.2%、料液比1∶28.9、提取時(shí)間33.75 min、提取次數(shù)4次。在此優(yōu)化條件下，無(wú)患子皂苷提取率的理論預(yù)測(cè)值可達(dá)到21.52%。根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作需要，將工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、料液比1:29、提取時(shí)間34 min、提取次數(shù)4次。經(jīng)驗(yàn)證在此條件下無(wú)患子皂苷的實(shí)際提取率為21.48%，與理論預(yù)測(cè)值較為接近，表明采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化無(wú)患子皂苷超聲輔助提取工藝的方法可行，研究結(jié)果將為云南省無(wú)患子植物資源進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考[33]。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of sapindus-saponin by using response surface methodology

DAN Han-long1,2, LI Na1,2, YE Hong-lian2, LIU Yun2, WANG Lian-chun2, ZHAO Ping1,2
(1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China; 2. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The ultrasound-assisted extraction of sapindus-saponin from the pericarps ofSapindus mukorossiwas carried out. The effects of ethanol concentration, material-liquid ratio, extraction times and extraction numbers on the extraction rate of saponins were investigated by single factor experiment, and the extraction process were optimized by using response surface methodology. The optimal extraction conditions were: 82.2% of ethanol concentration, 1:28.9 of material-liquid ratio, 33.75 minutes of extraction time, and 4 times of extraction number. Under this optimal condition, the theoretic extraction rate of sapindus-saponin reached 21.52%. According to the actual experiments, the optimum theoretic parameters were modif i ed as: ethanol concentration 82%, material-liquid ratio 1:29, extraction time 34 minutes and extraction number 4 times, and the actual extraction rate of sapindus-saponin was 21.48% , that is close to the theoretic value. The results show that the response surface method to optimize the ultrasonic-assisted extraction of sapindus-saponin is feasible.

Sapindus mukorossi; sapindus-saponin; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology

S789

A

1673-923X(2015)06-0107-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.020

2014-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260163）；西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（C1457）

但漢龍，碩士研究生 通訊作者：趙 平，研究員，博士生導(dǎo)師；E-mail：hypzhao@yahoo.com

但漢龍, 李 娜, 葉紅蓮,等. 響應(yīng)面優(yōu)化無(wú)患子皂苷超聲輔助提取工藝[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(6):107-113.

[本文編校：吳 彬]