小麥麩皮抗凍蛋白提取的關(guān)鍵因素及其優(yōu)化

金周筠 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

小麥麩皮抗凍蛋白提取的關(guān)鍵因素及其優(yōu)化

金周筠 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

研究小麥麩皮抗凍蛋白提取率偏低與熱滯活性（Thermal Hytersis Activity，THA）易破壞的問題。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗設(shè)計與響應(yīng)面分析方法對液料比、緩沖液pH、緩沖液濃度、飽和硫酸銨濃度這4個因素進(jìn)行優(yōu)化，建立響應(yīng)值（包括：蛋白提取率、THA）與各影響因素之間的回歸方程，得出最優(yōu)提取條件為液料比7.5∶1、緩沖液pH 7.8、緩沖液濃度29 mmol／L、飽和硫酸銨濃度100%，在此條件下蛋白提取率理論值為41.46%、THA 0.019 5℃；驗證試驗表明蛋白提取率為41.98%，THA為0.019℃，證明優(yōu)化結(jié)果是可靠的。

小麥麩皮抗凍蛋白 提取 響應(yīng)面分析 優(yōu)化

抗凍蛋白（Antifreeze Protein，AFP）是一種能夠抑制冰晶生長和重結(jié)晶的蛋白，能非依數(shù)性地降低溶液的冰點而對其熔點影響很小，這種冰點與熔點之間的差異稱為熱滯活性（Thermal Hysteresis Activity，THA），因此，抗凍蛋白又被稱為熱滯蛋白?？箖龅鞍自隰~類、昆蟲、植物、微生物等中均有分布，各來源的抗凍蛋白已成功運用于食品、生物、農(nóng)業(yè)等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。

2.2 兩組體格參數(shù)及實驗室指標(biāo)比較 結(jié)果(表1)表明：隨訪前，與非進(jìn)展組相比，進(jìn)展組BMI、腰圍、WHtR、WHR較大，ALT、AST、UA、TG較高，BUN、Scr、HDL-C較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)展組隨訪時間[(3.62±1.79)年]長于非進(jìn)展組[(3.11±1.81)年，P<0.05]。隨訪結(jié)束時，兩組間上述指標(biāo)差異與隨訪前一致(P<0.05)；隨訪結(jié)束時，進(jìn)展組FBG、HB、FT3高于非進(jìn)展組(P<0.05)。

1992年，Griffith等［3］提出獲得植物內(nèi)源抗凍蛋白，從經(jīng)低溫鍛煉的能夠忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥葉片質(zhì)外體中純化了該蛋白。目前，多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征，包括冬黑麥（SecalecerealeL.）、胡蘿卜（Daucus carota）、冬小麥（Triticum aestivum）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）等［4］。我國作為小麥生產(chǎn)大國，每年僅小麥加工副產(chǎn)物——小麥麩皮的產(chǎn)量即達(dá)2 000萬t以上，成本低廉，且安全性高；若從中提取出高活性的抗凍蛋白，將是豐富的可利用資源［5］。

根據(jù)以上課程，哲學(xué)要講授心理學(xué)、道義學(xué)(倫理學(xué))、論理學(xué)、純正哲學(xué)，不包含“印度及中國哲學(xué)”(東洋哲學(xué))。由后續(xù)情況看，哲學(xué)科因1881(明治14)年的改正而獨立后，開始講授新設(shè)科目“印度及中國哲學(xué)”(東洋哲學(xué))。

目前，抗凍蛋白提取最主要的問題是蛋白提取率偏低與熱滯活性易破壞的問題，如夏露等［6］在pH 8.0，提取時間3 h，液料比5∶1，條件下獲得的冬麥粗提抗凍蛋白提取率為30%，THA為0.016℃。金濤等［7］用真空滲透離心法提取燕麥抗凍蛋白，在50 mmol／L PBS，0.35 MPa真空度下，真空 1 h得率僅為0.085 mg／g。在預(yù)試驗階段，參考前人提取條件［8］，在液料比 5∶1、緩沖液 pH 8.0、緩沖液濃度 20 mmol／L、提取時間4 h、飽和硫酸銨濃度100%時，提取率僅為31.23%，THA為0.017 5℃。一般認(rèn)為，其影響因素主要包括液料、緩沖液濃度、提取時間及飽和硫酸銨濃度等，這些因素對以上2個指標(biāo)的影響或協(xié)同或拮抗。在參考米糠蛋白、燕麥蛋白的提取工藝的基礎(chǔ)上［9－11］，本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化抗凍蛋白的提取工藝參數(shù)，保證其熱滯活性不受損傷，為小麥副產(chǎn)物綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮由上海市崇明縣堡鎮(zhèn)小漾村提供。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker：碧云天生物技術(shù)研究所。

無機(jī)錨固膠：采用NK尼高無機(jī)錨固膠，相關(guān)安全性能指標(biāo)和工藝性能標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB 50728—2011《工程結(jié)構(gòu)加固材料安全性鑒定技術(shù)規(guī)范》第4.2節(jié)和第4.8節(jié)中Ⅰ類A級膠的規(guī)定，相關(guān)技術(shù)要求應(yīng)符合JGJ/T 271—2012《混凝土結(jié)構(gòu)工程無機(jī)材料后錨固技術(shù)規(guī)程》的相關(guān)規(guī)定。

2.1.3 緩沖液pH對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

1.2 儀器與設(shè)備

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，使用Design Expert軟件對液料比、緩沖液pH值、緩沖液濃度、飽和硫酸銨濃度4個因素分別在3個水平上進(jìn)行中心組合試驗設(shè)計，考察的指標(biāo)為蛋白提取率與THA。共有29個試驗點，其中包括16個析因點，5個中心點和8軸向點。軸向點代表了每個獨立變量的極值水平；中心點代表中心水平，重復(fù)7次以估計試驗誤差。響應(yīng)面分析因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

1.3 方法

1.3.1 小麥麩皮的預(yù)處理

當(dāng)然，臘味飯中最有年味的做法，當(dāng)屬臘味八寶飯。八寶飯多是甜味糯米飯，所謂八寶指的是杏仁、梅子、葡萄干之類的甜食。然而，咸味的臘味八寶飯，更能勾人食欲。八寶并不一定是八種食材，只是取其豐盛吉祥之意。臘味八寶飯主要采用干貨雜糧，寓意是五谷豐登，團(tuán)圓富貴。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取率的計算

采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白提取液中蛋白含量。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取工藝的研究

將20 g小麥麩皮置于燒杯中，加入一定比例、一定濃度的緩沖液，不停攪拌，在預(yù)設(shè)定提取時間結(jié)束后，離心分離，收集上清液，將上清液用不同濃度的飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，沉淀在蒸餾水中復(fù)溶，用截流相對分子質(zhì)量6 ku的透析膜對純水透析12 h，濃縮、凍干，獲得粗提物，并采用DSC法檢測其THA。

1.3.4 DSC法測定樣品的熱滯活性

參照陳廷超等［12］的方法稍作改動。將10μg樣品密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，降溫至－30℃，然后升溫至25℃，再降溫至－30℃。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態(tài)，稱為保留溫度（Th），停留2 min，再將溫度從Th降低至－30℃，重復(fù)上述過程，在不同的Th下停留2 min。記錄不同Th下，樣品結(jié)晶的起始溫度（T0），上述過程中升降溫的速率均為1.0℃／min。THA參照如下公式：

1.3.5 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

電泳參照LaemmLi的不連續(xù)系統(tǒng)，并稍作改進(jìn)，使用4%和15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的濃縮膠和分離膠。

古董市場里不光商品琳瑯滿目，而且各家店鋪的老板更是些狠角色，王祥還沒來得及開口問自己的東西怎么賣，就差點被人忽悠著買下一個“光緒帝用過的犀角杯”，幸好他沒這個閑錢。打這之后，王祥就不敢再找這些老板們做生意了，不過這趟也沒白來，王祥最終在古玩市場外找到了自己的“歸宿”——擺地攤。

1.3.6 蛋白的分離純化

粗提抗凍蛋白按照陽離子交換色譜、凝膠過濾色譜和高效液相色譜這3個步驟純化，對活性組分透析后凍干。

在采用20 mmol／L緩沖液、液料比6∶1、提取時間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究緩沖液不同pH對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖3可知，隨著緩沖液pH的升高，提取率逐漸增大。受緩沖液性質(zhì)的影響，其pH不宜高于8.0；且高pH易使目標(biāo)蛋白發(fā)生變性，因此未考慮進(jìn)一步提高pH已獲得更高的蛋白提取率。同時，由圖3可知，隨著pH的升高，THA也逐漸增大。因此，可以推斷，緩沖液pH對蛋白提取率及THA有較大影響。

分別試驗研究液料比、提取時間、緩沖液pH值、緩沖液濃度以及飽和硫酸銨濃度對小麥麩皮抗凍蛋白提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗設(shè)計的自變量及水平，以蛋白提取率與THA兩個指標(biāo)為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析（RSA）方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的回歸分析及顯著性檢驗，以確定提取最優(yōu)工藝條件。每個試驗點重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)處理過程中各自變量的水平轉(zhuǎn)換為無因次代碼表示：

式中：xi為自變量的代碼值；Xi為自變量的真實值；X0為自變量中心水平處真實值；ΔXi為步長。數(shù)據(jù)處理采用Design Expert軟件，將試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次方程回歸擬合得到各次項系數(shù)。在RSA給出的最優(yōu)條件下通過試驗證明預(yù)測的可靠性。

對以上兩模型分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在采用20 mmol／L PBS緩沖液（pH 7.4）、提取時間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究不同液料比對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖1可知，在液料比4∶1時，蛋白質(zhì)的提取率比較低，僅為23%左右，隨著液料比的上升，蛋白質(zhì)的提取率不斷上升，在液料比6∶1～8∶1之間時，提取率趨于最大，進(jìn)一步增加液料比對提取率影響不大。出于節(jié)能的考慮，將中心點定在液料比7∶1左右。同時，由圖1可知，液料比對THA無明顯影響。

圖1 液料比對小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.2 提取時間對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在采用20 mmol／L PBS緩沖液（pH 7.4）、液料比6∶1、80%飽和硫酸銨條件下，研究不同提取時間對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖2可知，提取時間對提取率無明顯影響，提取4 h與提取2 h相比，提取率僅提高了2個百分點左右，因此基本可認(rèn)為提取時間對蛋白質(zhì)的提取率不是關(guān)鍵因素。同時，由圖2可知，提取時間對THA無明顯影響。

圖2 提取時間對小麥麩皮提取率及THA的影響

GNSS RTK在低收入農(nóng)村科技幫扶工作中的應(yīng)用…………………………………… 劉愛軍，焦有權(quán)，黃海力（4-275）

將小麥麩皮粉碎過100目篩，常溫下儲藏備用。根據(jù)GB 5009.5—2010的標(biāo)準(zhǔn)測定，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.22%。

1.3.7 試驗設(shè)計

對隨機(jī)抽取的77名同學(xué)從專業(yè)理論知識、崗位技能水平、學(xué)習(xí)目標(biāo)的明確性、學(xué)習(xí)積極性等四個方面的個人水平提高進(jìn)行了調(diào)查，普遍認(rèn)為有幫助(約58%—66%)或者有很大幫助(約22%—28%)，也有少部分同學(xué)(約3.8%—8.7%)認(rèn)為存在問題，以學(xué)習(xí)積極性的提高存在困難為首?？梢姡n程建設(shè)在幫助學(xué)生提高個人水平方面滿意度情況較好

第七步：崗位練兵。按戰(zhàn)斗班組將隊員分為兩組，依次嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程開展崗位練兵，安全員要全程做好時間記錄和過程監(jiān)督，如發(fā)現(xiàn)練兵過程中存在未按崗位標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程執(zhí)行，則對照考核細(xì)則進(jìn)行加時懲罰；如發(fā)現(xiàn)不安全行為，應(yīng)立即進(jìn)行糾正。其他練兵人員要認(rèn)真觀察練兵過程。

圖3 緩沖液pH對小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.4 緩沖液濃度對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

在液料比6∶1、提取時間4 h、80%飽和硫酸銨條件下，研究緩沖液濃度（pH 7.4）對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響。由圖4可知，提取率隨著緩沖液濃度的增加呈上升趨勢，緩沖液濃度為20 mmol／L以上時，較10 mmol／L是的提取率上升了近10%，說明緩沖液濃度對是提高提取率的關(guān)鍵因素之一。造成這一較大影響的因素可能是：當(dāng)緩沖液達(dá)到某一濃度時，其離子強(qiáng)度增加，對目標(biāo)蛋白的作用加強(qiáng)，有助于其溶出。隨著PBS緩沖液濃度的進(jìn)一步提高，蛋白提取率無明顯變化，因此將中心點取在30 mmol／L較為合適。同時，由圖4可知，緩沖液濃度對THA無明顯影響。

圖4 緩沖液濃度對小麥麩皮提取率及THA的影響

2.1.5 飽和硫酸銨濃度對蛋白質(zhì)提取率及THA的影響

采用飽和硫酸銨溶液對蛋白上清液進(jìn)行沉淀，能有效富集蛋白質(zhì)。由圖5可知，蛋白質(zhì)提取率與飽和硫酸銨濃度基本正相關(guān)，飽和硫酸銨溶液的濃度越高，提取率越高，富集效果越好。因此，可采用100%對上清液進(jìn)行沉淀。由圖5可知，隨著飽和硫酸銨濃度的升高，THA有逐漸變大的趨勢，當(dāng)飽和硫酸銨濃度達(dá)80%時，THA增大趨勢變緩。

圖5 飽和硫酸銨濃度對小麥麩皮提取率及THA的影響

2.2 中心組合試驗設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)

2.2.1 模型的建立

Pyris Diamond差示掃描量熱儀：美國Perkin－Elmer公司；透析膜（44 mm，截留分子質(zhì)量6 ku）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；UV－2800型紫外－可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

由Design Expert軟件分別對蛋白提取率與THA結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到Y(jié)1（蛋白提取率）及Y2（THA）對自變量的多項式模型方程。

值得說明的是,關(guān)于為什么上述斜向垂直環(huán)流圈在某一時段能夠形成而在另一時段不能形成的原因則還需進(jìn)一步探索。

由表3可知，Y1模型方程的P值小于0.001，Y2模型方程的P值小于0.05，表明模型方程均為顯著。兩模型方程的決定系數(shù)（R2）分別為0.938 6與0.801 3，R2均大于0.80，可以認(rèn)為方程的擬合情況較好［13－15］。因此